Cell | 樊嘉/季彤/周俭/孙云帆/张陈平等合作揭示癌症细胞通过“跨器官神经免疫回路”逃避免疫监视

采用单细胞转录组、空间转录组、CODEX、蛋白质组、CyTOF等多组学技术，发现处于免疫压力下的癌细胞通过激活ATF4依赖性途径分泌SLIT2，该途径激活支配肿瘤的伤害感受神经元并加重癌症诱导的疼痛。这种激活刺激肿瘤引流淋巴结(TDLN)神经支配的伤害感受神经元，并增加降钙素基因相关肽(CGRP)的分泌，将TDLNs重塑为免疫抑制状态。因此，来自免疫抑制的TDLNs的CCL5分泌减少促进了肿瘤相关巨噬细胞的M2样极化，促进了肿瘤生长并降低了免疫检查点阻断(ICB)功效。靶向伤害感受神经元或ATF4-SLIT2-CGRP轴恢复免疫活性，减轻癌症诱导的疼痛，并改善ICB反应。该发现揭示了一个器官间的神经免疫回路被癌症选择以逃避免疫监视，为理解肿瘤免疫逃逸提供了新视角。

首先对69例HNSCC患者的肿瘤组织进行多重免疫荧光检测，发现肿瘤内伤害感受神经元密度与患者术前疼痛程度呈正相关。RNA测序结果显示，高密度伤害感受神经元区域M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的积累显著增加（图1A-C）。在伤害感受神经元丰富区有更多的M1样和M2样TAMs（图1D-E）。血浆DIA蛋白质组学分析显示，在伤害感受神经元丰富的疼痛高组中富集的蛋白质与神经系统发育和先天免疫反应呈正相关，而在伤害感受神经元贫乏的疼痛低组中富集的蛋白质与多种免疫效应反应呈正相关，提示伤害感受神经元激活与系统性免疫抑制状态密切相关（图1G）。CyTOF分析显示，在伤害感受神经元丰富的疼痛高组中，naïve CD8+ T和effector CD8+ T细胞比例下降，同时classical、non-classical、transitional单核细胞比例增加（图1H-I）。这些结果表明，伤害感受神经元密度高的HNSCC患者外周血CD8+ T细胞减少，单核细胞增加。

图1高密度的伤害感受神经元与HNSCC患者的TAM积累相关

为了研究肿瘤TAM与伤害感受神经元的相互作用，建立了3种小鼠移植瘤模型。TAM切除没有改变肿瘤体积，但显著减轻了肿瘤诱导的机械超敏反应（图2A）。与野生型小鼠相比，DT治疗显著减轻了肿瘤诱导的机械超敏反应（图2B）。通过单细胞RNA-seq （scRNA-seq）和空间转录组测序（ST-seq）对HNSCC患者中TAM的转录特征进行了探索。GSVA分析显示，位于TAM spot 50 μm范围内的癌细胞的感觉疼痛感知和轴突发生相关基因的表达上调，而在其他细胞群中没有观察到这种影响（图2C），表明癌细胞在TAM压力下激活了伤害感受神经元。TAM预处理的癌细胞诱导43.6%的辣椒素反应性TG神经元的钙通量，并促进CGRP TG神经元的轴突发生（图2E），这些结果支持癌细胞在TAM压力下激活伤害感受神经元。

TAM处理增加了内质网应激相关基因的转录和蛋白水平，包括BIP、PERK、ATF4和CHOP（图2F）。在人HNSCC组织中，在靠近TAM的癌细胞中发现了更高的ATF4水平（图2G）。ATF4敲除后，辣椒素反应性TG神经元诱导钙通量的能力受损，促进CGRP TG神经元轴突发生的能力降低（图2H-I）。进一步的体外实验表明，TAM处理以ATF4依赖的方式提高了SCC7、B16F10和MC57G细胞的SLIT2合成和分泌（图2j-K）。此外，SLIT2在癌细胞中与ATF4共定位，TAM缺失降低了癌细胞中SLIT2的表达（图2L）。将rmSLIT2注射到ATF4-KO SCC7/ B16F10舌异种移植物中可以恢复ATF4-KO引起的机械敏感性减轻（图2N）。同样，rmSLIT2诱导37.2%的辣椒素反应性TG神经元钙内流，并促进CGRP TG神经元轴突发生。综上所述，这些结果表明TAM压力下的癌细胞通过ATF4介导的SLIT2分泌激活伤害感受神经元。

图2 TAM压力下的癌细胞通过ATF4介导SLIT2分泌激活伤害感受神经元

体外实验验证结果表明，tongue-iNNs的光遗传刺激触发了颈部 LN-iNNs的激活。因此进一步探讨了TDLN-iNN活性是否影响肿瘤生长。在小鼠模型中，tongue-iNNs的光遗传刺激促进了肿瘤的生长（图4C）。然而，在肿瘤接种前进行宫颈淋巴结切除术的小鼠中，所有这些影响都不存在（图4B-C），这表明TDLN是伤害感觉神经元介导的肿瘤生长所必需的。此外，TDLN-iNNs的化学发生抑制和RTX介导的系统性伤害性失神经控制都没有减少Slit2-KO或Atf4-KO B16F10/SCC7小鼠模型的肿瘤体积（图4F-G），肿瘤内给药rmSLIT2后肿瘤得以挽救。这些结果表明，癌细胞固有的ATF4-SLIT2轴是TDLN-iNN活性驱动肿瘤生长所必需的。

图4 TDLN-iNN介导TDLNs分泌CGRP促进肿瘤生长

将来自有或没有TDLN-iNNs化学发生抑制的供体小鼠的TDLN驻留免疫细胞瘤内注射到颈部淋巴结切除的舌异种移植受体小鼠（图5A-B）。肿瘤内注射TDLN-iNNs化学发生抑制的小鼠的TDLN驻留免疫细胞CM有效地减少了受体小鼠的舌移植体积（图5C）。此外，化学发生抑制TDLN-iNNs后，免疫细胞比例发生了变化，包括CD8+ T细胞和cDCs细胞上调，并伴有cDC-CD8+ T细胞共定位壁龛的增加（图5E-F），这是激活TDLN中抗肿瘤T细胞反应的关键。此外，在体外DC-CD8+ T细胞共培养中，化学发生抑制TDLN-iNNs的小鼠TDLN中分泌的granzyme Bhigh和IFN-γhigh TNF-αhigh CD8+ T细胞的能力增强（图5K）。综上所述，这些结果表明TDLN-iNN活性将TDLN重塑为免疫抑制状态。

此外，当与Slit2-KO或Atf4-KO癌细胞接种时，TDLN-iNNs的化学发生抑制未能增加TDLN中CD8+ T细胞和γδ T细胞的比例，并激活cDCs。这种功能损失通过肿瘤内注射rmSLIT2得以恢复（图5L-M），表明癌细胞固有的ATF4-SLIT2轴是伤害神经元介导的TDLN重塑所必需的。最后，TDLN-iNNs中的Calca-KO表型显示了TDLN-iNNs化学发生抑制所引起的变化（图5N），而TDLN周围的CGRP局部给药逆转了TDLN-iNNs化学发生抑制和RTX介导的全身伤害感觉去神经支配所引起的影响。这些结果表明，TDLN的重塑是由Slit2介导的TDLN-iNNs激活和TDLN中CGRP的释放驱动。

图5 TDLN-iNN活性使TDLN进入免疫抑制状态

RNA-seq测序结果显示，TDLN-iNN抑制后上调的基因集和tongue-iNNs光遗传刺激后下调的基因集都在先天免疫激活中富集（图6A）。CyTOF表明，化学发生抑制TDLN-iNNs降低了M2样TAM和PD1 CD8+ T细胞的比例，同时cDCs细胞比例增加（图6B-C）。对TDLN-iNNs有或没有化学发生抑制的小鼠的舌移植免疫细胞进行了单细胞测序，细胞相互作用分析显示，TAM与TDLN免疫细胞的相互作用对最多（图6D）。在CSF1R Ab处理的小鼠中，系统性伤害感觉去神经支配或光遗传刺激的肿瘤体积影响也消失了（图6G-H）。在TAM基因缺失模型中，TDLN-iNNs或系统性伤害感觉去神经的化学发生抑制未能减少舌移植体积（图6I-J）。这些结果表明，伤害感受神经元介导的免疫抑制TDLN通过TAM促进肿瘤生长。

图6 免疫抑制的TDLN通过TAM促进肿瘤生长

scRNA-seq轨迹分析显示，TDLN-iNNs中的化学发生抑制使TAM从M2样表型转向M1样表型（图7A）。在TDLN-iNNs的化学发生抑制下，舌异种移植物中CD206high CD86low CD11b F4/80 TAM比例降低（图7B），而局部给药CGRP则可部分逆转（图7C）。在TDLN-iNNs的Calca-KO舌异种移植物中，也观察到类似的M2样TAM比例降低（图7H）。TDLN-iNNs的化学发生抑制未能降低Slit2-KO或Atf4-KO舌异种移植物中M2样TAM的比例，通过瘤内注射rmSLIT2恢复了这一效果（图7K和7L）。总之，这些结果表明，伤害感受神经元介导的免疫抑制TDLN促进了TAM的M2样极化。此外，来自HNSCC-队列B的伤害感受神经元丰富的疼痛高组的HNSCC患者血浆CCL5水平较低，TCGA数据库中较高的CCL5水平与患者在多种人类肿瘤中较高的患者总生存率相关。综上所述，这些结果表明，伤害感受神经元介导的免疫抑制TDLN通过减少TDLN中CCL5的分泌来促进TAM的M2样极化。

图7 免疫抑制TDLN引起CCL5分泌减少，并促进TAM的M2样极化