【Cre-LoxP系统】经验篇 | AAV-Cre在不同器官中的应用

Cre-LoxP系统是体内基因功能研究的金标准工具。利用重组酶Cre的时空特异性表达，可实现对LoxP位点flanked基因的精准编辑。其中，腺相关病毒载体（Adeno-associated virus, AAV）递送Cre重组酶因其低免疫原性、长期表达和组织嗜性多样，成为特定组织器官基因调控研究的利器。然而，不同脏器对AAV血清型的转导效率差异显著，选择合适血清型和特异性启动子是实验成功的关键。本文将从Cre-LoxP系统的原理出发，聚焦AAV-Cre在主要脏器的应用经验

Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一种重组酶，来源于P1噬菌体，其基因编码区序列全长1029bp，为38kDa大小的、由343个氨基酸组成的多肽单体蛋白。Cre重组酶的C-末端结构域包含催化活性位点，能够催化DNA分子中特定位点之间的重组，同时，Cre还能识别特异的DNA序列，即LoxP位点，使两个LoxP位点间发生基因重组。

LoxP（Locus of X-over P1）是位于P1噬菌体中长度为34bp的一段序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成。其中的反向回文序列是Cre重组酶的识别和结合区域，间隔序列决定LoxP序列的方向。

一般而言，当细胞基因组内存在两个LoxP位点时，Cre重组酶会诱导两个LoxP位点间的序列发生重组。重组的结果取决于两个LoxP位点的方向，主要有以下几种可能：

① 若两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效诱导两个LoxP位点间的序列删除（Deletion）（图A）；

② 若两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转（Inversion）（图B）；

③ 若两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位，即基因转座（Translocation）（图C）；

④ 若四个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导LoxP间的序列互换（Cassette exchange）（图D）。

Cre-LoxP诱导基因重组的方式

基于以上方式，科研人员研发了多种策略来实现Cre依赖的基因表达，其中应用最广的要数LSL序列（即条件性基因选择）。该策略是在目标基因前插入两侧带有同向LoxP位点的转录终止元件（即“Lox-Stop-Lox”结构）来阻断基因表达。当细胞表达Cre重组酶时，该酶特异性识别并催化两个LoxP位点之间的DNA重组，精确切除位于其间的终止序列。移除“Stop”元件后，下游基因的转录障碍被解除，从而实现在特定表达Cre的细胞或组织中激活目标基因。

Cre依赖的基因表达——LSL策略

除了LSL序列，DIO/DO序列、MADM系统等也是基于Cre-LoxP系统开发的基因调控策略，在一些研究中发挥了重要作用。此外，经过现代基因工程方法对Cre和LoxP元件的改造，Cre-LoxP系统实现了更加丰富的条件性重组策略。

利用Cre-LoxP系统在小鼠体内进行条件性基因调控，通常情况下依靠转基因小鼠的杂交来实现，即Cre小鼠和Flox小鼠至少杂交两代。该方法耗时长且成本高，并且对于局部组织、特定器官的基因调控难度较大。

AAV具有血清型种类多样、免疫原性低、长期稳定表达基因等优势，在基因功能研究和基因治疗递送载体中占据主导地位。因此可以选择合适血清型的AAV，配合细胞特异性启动子，将Cre重组酶递送至目标细胞中。

AAV-Cre诱导条件性基因敲除相比转基因小鼠依赖的Cre-LoxP系统，核心优势在于：

早在2014年，德国海德堡大学的研究团队就已经利用AAV介导Cre重组酶在成年小鼠中表达，以实现快速高效地诱导心脏基因敲除。在条件性敲除模型（Srf-flex1小鼠）中注射带有心肌细胞特异性启动子的AAV9-Cre以消除心肌中转录因子血清反应因子（SRF），注射四周后观察到心脏SRF mRNA和蛋白质表达显著下降。

Srf-flex1小鼠注射AAV9-Cre使得心脏中SRF表达显著减少

（Stanislas Werfel, et al., Cardiovasc Res., 2014）

间歇性禁食（IF）在减轻肥胖症方面起着关键作用，但其生物学机制需要进一步阐明。同济大学栾冰、韩峻峰和复旦大学周东雷共同通讯在Advanced Science发表研究成果，揭示了一种IF诱导的肝因子Orosomucoid 2（Orm2）通过GP130/IL23R-p38信号通路介导脂肪褐变，Orm2有希望成为肥胖治疗的靶点。研究人员将AAV介导的Adipoq-Cre载体递送至IL23R^flox/flox小鼠的皮下白色脂肪组织（scWAT）中，构建了脂肪细胞特异性IL23R敲除小鼠（IL23R AKO）。在肝脏中过表达Orm2可诱导野生型小鼠脂肪组织褐变，但IL23R AKO小鼠未出现褐变，说明Orm2能够特异性地通过调控脂肪细胞中的IL23R来增强产热过程。

IL23R^f/f小鼠注射AAV-Adipoq-Cre构建IL23R AKO

（Xuejuan Zhu, et al., Adv Sci., 2024）

肝脏缺血再灌注损伤（IRI）是肝切除和移植术后常见的并发症，但其潜在机制尚未完全阐明。温州医科大学李校堃院士团队在Nature Communications 发表研究成果，揭示肝星状细胞（HSCs）分泌的成纤维细胞生长因子18（FGF18）通过USP16/KEAP1/Nrf2信号通路减轻肝细胞损伤，而HSC特异性FGF18缺失会加重肝脏IRI。研究人员将AAV-TBG-Cre通过尾静脉注射的方式注射进Usp16^f/f小鼠体内，构建了肝脏中USP16敲低的Usp16^△HEP小鼠。进一步实验发现过表达FGF18无法减轻Usp16^△HEP小鼠的IRI，说明FGF18对肝脏IRI的保护作用依赖于USP16。

Usp16^△HEP小鼠的构建

（Gaozan Tong, et al., Nat Commun., 2023）

动脉粥样硬化性心血管疾病一直是全球发病率和死亡率的主要原因，高密度脂蛋白（HDL）与其发生发展关系密切。复旦大学徐延勇和首都医科大学李晶共同通讯在Developmental Cell发表研究成果，发现肝细胞脂质运载蛋白-2（Lcn2）通过阻断Nedd4-1介导的SR-BI泛素化来调节高密度脂蛋白（HDL）代谢和动脉粥样硬化。研究人员将AAV8-TBG-Cre病毒通过静脉注射感染Lcn2^fl/fl小鼠、Lcn2^fl/flLdlr^-/-小鼠和Srb1^fl/fl小鼠，产生肝细胞特异性敲除小鼠，包括Lcn2^Hep-/-小鼠、Lcn2^Hep-/-Ldlr^-/-小鼠和Srb1^Hep-/-小鼠，进而进行后续实验。

小鼠肝细胞中Lcn2敲除和Srb1敲除后的效果

（Shuwei Hu, et al., Dev Cell., 2023）

mT/mG（ROSA-pCA-loxp-mT-pA-loxp-mG-pA）鼠是一种双荧光报告鼠，这种鼠在正常情况下表达定位在膜上的红色荧光蛋白（TdTomato），而当细胞表达Cre后，则表达定位在膜上的绿色荧光蛋白（GFP）。Alb为成年动物肝细胞特异性启动子，将AAV8-Alb-Cre病毒尾静脉注射mT/mG小鼠，可发现特异性感染小鼠肝脏组织（绿色），而心脏组织未被感染（表现为红色）。这是LSL策略的一种经典应用方式。

mT/mG小鼠尾静脉注射AAV8-Alb-Cre病毒，肝脏（左）和心脏（右）的荧光表型

自闭症相关基因富含突触蛋白和表观遗传调控因子，但这些染色质调控因子如何导致自闭症特征尚不清楚。上海科技大学管吉松教授团队发现Ash1l单倍体不足导致小鼠ASD样行为，破坏活动依赖的突触修剪过程，并探索其机制。研究人员将AAV-hSyn-Cre注射于Ash1l^fl/fl小鼠右侧AUD区条件性敲除Ash1l基因，发现Ash1l以细胞自主效应的方式介导皮层神经元的活动依赖的突触修剪过程。

注射AAV-hSyn-Cre构建Ash1l缺陷小鼠

（Yan Yuze, et al., Neuron., 2022）