钙成像技术 | 洞察神经活动的窗口，常见钙离子指示剂选择

脑科学研究的关键是要实现对神经元集群活动的实时观察，并通过特定神经环路的结构追踪及其活动操纵，研究其对脑功能的充分性和必要性，进而在全脑尺度上解析神经环路的功能和结构。

钙离子成像技术（Calcium imaging）是指利用可遗传编码钙离子指示剂（GECIs）监测组织内钙离子浓度的方法，具有细胞分辨率高、可以长期观察、多色成像等优势，常用于神经系统的研究，指示神经元内钙离子的变化，提示神经元活动。

钙成像技术基于神经元活动与细胞内钙离子浓度变化的严格对应关系。在哺乳动物的神经系统中，钙离子是一类重要的神经元胞内信号分子，当神经元活动的时候，胞内钙离子浓度能上升10-100倍，且钙离子对于突触囊泡释放必不可少，这意味着神经元钙离子浓度可以表征突触传递和神经元活动。因而，这种钙离子浓度的升高可以被钙离子指示剂（如GCaMP系列、G-CaMP9a等）检测到，这些指示剂在结合钙离子后会发生荧光增强，可以通过光纤记录、双光子显微镜等观察，从而达到监测神经元活动的目的。

目前常用的基因编码钙离子指示剂就是将来自于绿色荧光蛋白（GFP）及其变体的荧光蛋白质，与钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶M13域融合。当钙离子浓度上升时，会导致M13与CaM结合，从而改变cpEGFP的构象，将其从无荧光的状态变为绿色荧光。包括G-CaMP9a、jGCaMP8、jGCaMP7、GCaMP6、GCaMP-X等。

GCaMP蛋白的基本结构和原理（Ali Gheisari, 2017）

G-CaMP9a是由日本东京大学医学院的Haruhiko Bito教授团队开发的新型绿色GECI，与GCaMP6f和6s相比，其具有高敏感、更快速动力学、高信噪比等优势。

jGCaMP8系列由HHMI Janelia的Loren L. Looger实验室团队开发的全新一代GCaMP蛋白，jGCaMP8系列包括jGCaMP8s、jGCaMP8f、jGCaMP8m，具有快速动力学，其荧光信号上升时间比之前的GCaMP版本快近十倍。

• jGCaMP8s：高敏感，快速上升，缓慢衰减，比 jGCaMP7s 敏感2倍，比 jGCaMP7f 快2倍以上（1 AP 时）。

• jGCaMP8m：中等敏感，快速上升，中等衰减，上升时间比 jGCaMP7f 快近 4 倍，灵敏度高 3.5 倍。

• jGCaMP8f（快速）：快速上升，快速衰减，比 jGCaMP7f 上升时间快 4 倍，衰减时间快 2.5 倍。

jGCaMP7系列是由HHMI Janelia的Karel Svoboda、Loren Looger、Vivek Jayaraman等实验团队合作开发的，包括四类不同特点的蛋白：jGCaMP7s、jGCaMP7f、jGCaMP7b、jGCaMP7c，相比较GCaMP6，具有更快的动力学和更高的信噪比。

• jGCaMP7s：灵敏性为GCaMP6s的5倍以上，适用于更强的检测单动作电位反应或群体活动实验。

• jGCaMP7f：快速动力学，其反应速率为GCaMP6f的5倍，适用于更强的检测单动作电位反应或群体活动实验。

• jGCaMP7b：明亮的背景荧光，其灵敏度为GCaMP6s的3倍，荧光亮度增强50%，适用于检测神经元突起或神经纤维。

• jGCaMP7c：高对比度，低背景，信号清晰，适用于大范围成像。

GCaMP6系列是目前使用最广泛的GECI，包含GCaMP6s、GCaMP6m和GCaMP6f三种亚型。

• GCaMP6s：高敏感，适合检测低频信号。

• GCaMP6m：中等动力学，应用范围广。

• GCaMP6f：快速动力学，适合检测高频信号。

GCaMP-X：大多数钙指示蛋白上都带有CaM（钙调蛋白），可能会影响细胞CaM通路中的下游反应。2018年清华大学刘晓冬教授团队开发了新型无损的钙离子指示剂——GCaMP-X，可保护依赖于L型钙通道的兴奋-转录耦合免受干扰，有效地减小了外源钙指示剂对细胞造成的影响，同时仍表现出部分GCaMP的优良Ca2+感应特性。适合超长时程钙信号的监测。

除了基于GFP等绿色荧光蛋白为基础的钙离子指示蛋白外，科学家们还开发了许多其他荧光的GECIs，为钙成像实验提供了更多的选择：

jRGECO1a：是基于mApple开发的一种红色钙离子指示蛋白，其钙亲和力更强，灵敏度与GCaMP6相当，适合检测较弱的钙信号，此外还可以与GCaMP6系列结合使用，追踪脑内神经元活动。

jRCaMP1：基于mRuby开发的红色GECIs，相较于RCaMP1h，jRCaMP1a和jRCaMP1b具有更高的灵敏度和动力学曲线，使它们适合于活体内的快速神经活动成像。且不容易被蓝光激活，这使得它们更适用于与光遗传学或GCaMP系列钙成像配合的操作。

XCaMP系列：是基于CaMKK为骨架，通过一系列的突变筛选，包括四种不同颜色：蓝色的XCaMP-B，绿色的XCaMP-G，橙色的XCaMP-O和红色的XCaMP-R。其中XCaMP-G的荧光强度比GCaMP6强，动作电位刺激诱发的钙离子反应性能也比GCaMP6有明显提高。结合特定的神经元特异的表达方法，可实现在自由活动状态下同时监测特定行为中不同神经元类型的活动，结合双光子显微镜，进行微结构功能成像，实现对突触前和突触后结构同时双色成像。

一种能够兼顾全局和微观的新型钙成像技术，包含CaMPARI以及CaMPARI2（第二代）。其原理在于，CaMPARI蛋白在正常状态下会发出绿色荧光，而如果对这种蛋白同时使用高浓度钙离子与紫外光处理，它就会不可逆转变成另一种能发出红色荧光的构象，即实现将瞬间的神经元活动变成红色荧光蛋白表达。研究人员通过转基因技术将这种新型蛋白导入到实验动物的神经系统中，然后用高强度的紫外光照射动物的大脑，通过检查荧光，找到发红色荧光的神经元，这些神经元即是在紫外光照射期间活跃的神经元。

2023年北京师范大学的王友军团队、章晓辉团队与中国科技大学的唐爱辉团队合作开发的一类新型GECIs， 相比于jGCaMP8f和最广泛使用的GCaMP6s，NEMO系列探针对胞内钙信号的反应速度相当，但更灵敏，具有更高的信噪比，且反应幅度提高约10倍。其中的NEMOf适合检测快速信号，NEMOs适用于小的钙信号变化，NEMOc适宜用更大的钙信号检测，而NEMOm则是一个更通用的版本。

参考文献

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