Cell | 人类骨髓微环境的细胞生物地图

美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Kai Tan与Ling Qin共同在Cell发表题为Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging的文章。研究发现了多种非造血细胞亚型，揭示了人类骨髓中非造血细胞和造血细胞的重要性和相互作用，以及早期骨髓造血过程中特定细胞类型的空间分布。这项研究提供了一个全面的、空间分辨的人类骨髓图谱，揭示了以前未被重视的细胞异质性和空间组织。不仅促进了对人类造血的理解，而且为研究健康和疾病背景下的骨髓niche生物学提供了宝贵的资源。

为了揭示人类骨髓的细胞组成，捕获了造血细胞（hematopoietic cells）、稀有造血干细胞和祖细胞（HSPCs）及非造血微环境细胞（non-hematopoietic microenvironmental cells），并用于scRNA-seq（图1A）。从 16 名接受过髋关节置换手术患者的新鲜股骨头中采集了骨髓，其中 12 个样本进行了 scRNA-seq 测序，另外 12 个样本进行了 CODEX，对 53417 个造血细胞和 29325 个非造血细胞进行了scRNA-seq（图 1B 和 1C）。

分析了非造血细胞，发现了三个主要细胞系：血管平滑肌细胞（VSMC）（ACTA2、RGS5 和 TAGLN）、EC（CDH5、PECAM1 和 VWF）和间充质细胞（CXCL12 和 PDGFRA）（图 1B-1D）。分析表明，骨髓中这些细胞的细胞多样性远高于现有的 scRNA-seq 参考文献。重要的是，除了表达炎症细胞因子的细胞类型（成熟的中性粒细胞和单核细胞，如 CXCL8 和IL-1B）外，没有观察到炎症反应特征。

图1人骨髓造血和非造血细胞的单细胞图谱

在间充质细胞中发现了明显的异质性，并确定了骨细胞（NCAM1、SPP1 和 BGLAP）、脂肪细胞（APOE、LPL、PPARG 和 CEBPA）和成纤维细胞（PDPN、CSPG4、DCN 和 DPT）（图 2A和 2B）。成骨细胞分为 IBSP/BGLAP 高的osteoblast和 IBSP/BGLAP 低的Osteo-MSC。尽管没有捕获到脂肪细胞，但还是发现了一个高表达CXCL12和脂肪基因（如 CEBPA、PPARG、APOE 和 LPL）的细胞群（Adipo-MSC）。发现了THY1+ MSC，虽然高表达脂肪细胞基因，但也有独特的表达谱（THY1和LBP）。观察到了表达 CXCL12、DPT 和 NT5E 以及非常特异地表达 PDPN 和 HAS1 的成纤维细胞样细胞（Fibro-MSC）。还发现了APOD+ MSC，因无法将其与之前已知的人类或小鼠细胞类型联系起来，所以将其命名为 APOD+ MSC。

CytoTRACE分析确定Fibro-MSC是间充质干细胞亚群中的起始细胞，THY1+ MSC的CytoTRACE得分也很高，这表明它们可能也更像起始细胞（图 2C 和 2D）。为了验证Fibro-MSC和THY1+ MSC更像干/祖细胞，进行了CFU（集落形成单位）检测。Podoplanin+ Fibro-MSC的成纤维细胞集落形成能力最高，其次是THY1+ MSC，而Osteo-MSCs和Adipo-MSC的成纤维细胞集落形成能力最低（图2E）。还捕捉到了骨髓 ECs 的两大类--AECs 和 SECs（图 2G）。AECs的CXCL12、ICAM2和PODXL表达量较高，但EPHB4和NR2F2等表达量低于SECs，后者表达了更多与内皮-造血细胞相互作用相关的基因（如ACKR1和SELE）（图2H）。

图2人类骨髓的非造血细胞组成

研究发现不同类型的间充质干细胞擅长产生特定的支持因子，如CXCL12 在Adipo-MSCs 和THY1+MSCs中表达最高，而 IGF1 则主要在Fibro-MSCs中表达。利用 CellChat系统地研究了骨髓细胞之间的相互作用，CXCL12 和 SELE 分别显示了间充质干细胞和 SEC 与不同 HSPC 亚群的相互作用（图 3B）。为了验证HSPC 与间充质干细胞亚群之间的相互作用，对分选的间充质干细胞亚群和分离的 CD34+ 细胞进行了共培养发现，分选的Adipo、Osteo和THY1+间充质干细胞显著保留了原始Lin-CD34+ CD38-细胞，以及形成Fibro-MSCs的强烈趋势，而在单培养中，这些细胞仅有少量保留（图3C）。

接下来重点研究了已知对骨髓造血有重要作用的因子。IL-7 主要由Adipo-MSCs和 THY1+ MSCs产生；在人类骨髓中，ECs 和 VSMCs 确实是 DLL1、DLL4、JAG1 和 JAG2 的主要贡献者；其中动脉血管（AECs 和 VSMCs）表达的 JAG1 最多（图 3A）。还注意到，Notch 信号从间质细胞传出，但弱于内皮细胞驱动的 Notch 信号（图 3E）。有趣的是，VSMC 也通过 NOTCH3 接收到大量 Notch 信号传入，这些信号可能来自 AECs（图 3F）。值得注意的是，所有非造血细胞及 HSPCs 都会在一定程度上接收 Notch 信号，这就提出了niche之间存在串扰和协调调控的可能性。

图3揭示了造血细胞和非造血细胞类型之间的信号传递模式

对 12 个标本进行了CODEX分析，基于scRNA-seq数据，进行设计并验证（53种抗体+DAPI）（图4A和4B）。注释了 803,132 个细胞，32 种细胞类型，包括immunophenotypic HSCs (Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+) 和Schwann cells（PLP1+ CD271+）；并将鉴定出的非造血细胞细分为 AECs、SECs、VSMCs、endosteal cells、Adipo-MSCs 和 THY1+ MSCs（图 4C）。此外，CODEX与scRNA-seq数据映射良好，匹配的细胞类型得分非常高。该注释参考图是造血细胞在其微环境背景下的细胞拓扑综合图谱，展示了这两个图谱在了解人类骨髓细胞解剖学方面的互补性。

图4揭示了人类骨髓的空间细胞拓扑结构

对15个CN进行功能分析，发现HSPCs主要存在于混合系邻近区（CN7 和 CN8），SPINK2+ HSPCs 则少量存在于myeloid/lymphoid (CN5)和early myeloid/arteriolar (CN4)。淋巴祖细胞（如 CLPs 和未成熟 B 细胞）主要存在于mixed lineage（CN7 和 CN8）、plasma cell/arteriolar（CN3）和peri-arteriolar lymphoid（CN2）邻近区。富含 GMP/myeloblasts和早期髓系祖细胞（EMPs）的两个邻域（CN4 和 CN6），沿骨膜内表面和动脉周围分布（图 5A-5C）。血管/内膜/间充质干细胞邻域高度富集了施旺细胞。所有动脉和混合系邻域（CN1-4 和 CN7-8）都富集了Adipo- MSCs和 THY1+ MSCs（图 5A）。此外，在scRNA-seq 数据中，EMPs 的缺氧特征得分最低（图 5E），与CODEX发现一致。鉴于骨髓是一个广泛的缺氧环境，表明一个相对富氧的生态位与早期骨髓造血相关。总之，peri-arteriolar 和endosteal niches并不像已有文献报道的那样互不关联，它们可能以某种方式合作，对早期骨髓造血起着至关重要的作用。

图5为 GMP/早期髓系祖细胞提供了oxygen-rich arteriolar/endosteal niche

使用point pattern analysis分析了细胞类型或邻域与新注释结构之间的距离，发现动脉血管最接近骨骼；central niche的特征是富含sinusoids, adipocytes, stroma和macrophages（图 6A 和 6B）。发现了之前分析并不明显的空间模式，Lin-SPINK2+ HSPCs 和SPINK2-CD34+ HSPCs与脂肪细胞的距离都比预期的要近（图 6D 和 6E）；且CODEX结果也表明，这两种类型的 HSPCs 都与脂肪细胞频繁接触（图 6F）。还发现 HSPCs 接近巨噬细胞，但更原始的 SPINK2+HSPCs 并不如此（图 6E）。相比之下，成熟的髓样细胞最接近sinusoids，表明成熟发生在central peri-sinusoidal niche（图6D）。总之，这些数据表明髓系发育存在空间限制，最早的髓系祖细胞在adipocytic niche中由 HSPCs 分化而成，然后迁移到相对高氧的arterio-endosteal early myeloid niche，最后迁移到mature near sinusoids并成熟（图 6G）。

图6 骨髓微环境的全面结构分析

通过scRNA-seq，作者在人类骨髓中鉴定了不同的间充质基质细胞（MSC）亚群、两个内皮细胞亚群和一个血管平滑肌亚群。发现了以前未表征的MSC群体，如THY1+MSC和APOD+MSC，这突出了以前依赖骨髓吸出物（aspirate）的研究的局限性：只容易捕获脂肪细胞MSC（Adipo-MSC）。使用CODEX对32种细胞类型的120多万个细胞进行了空间分布，揭示了人类骨髓的细胞形貌。确定了不同的细胞niche，包括富含粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）和早期髓系祖细胞（early myeloid progenitor, EMP）的早期髓系/小动脉niche。有趣的是，这个区域现出相对高氧的环境，这表明早期骨髓生成发生在氧合良好的部位。此外，作者发现造血干细胞和祖细胞（HSPC），特别是最原始的SPINK2+HSPC，与脂肪细胞之间存在显著的空间关联。这一发现挑战了将骨内膜（endosteal）生态位作为主要HSPC生态位的传统观点，并强调了脂肪细胞在调节人类造血中的潜在重要性。