项目文章（IF 12.9）| 周许辉/陶霞/孟怡辰研究揭示一种新型DCSTAMP拮抗剂通过调节RAP1B-RAC1介导的细胞骨架重塑来抑制破骨细胞前体融合

DCSTAMP基因区域（±10 kb，hg19，chr11: 105342024-105378917）分析显示，该基因区域与eBMD 及DCSTAMP 表达存在显著关联。在该区域的 1202 个SNP中，有 89 个与 eBMD 显著相关，其中 rs2514663 是最显著的SNP位点（图1a）。证实了 DCSTAMP 表达升高与 eBMD 降低存在关联（图1a）。先前研究已证实DCSTAMP结构域，特别是其尾部区域（氨基酸398-470），在蛋白质功能和破骨细胞活性中发挥着关键作用（图1b）。为了研究DCSTAMP结构域完整性的重要性，构建了氨基酸398-470缺失的Dcstamp-tail敲除小鼠（Dcstamp-tail−/−）（图1c-e）。雌性Dcstamp-tail−/−小鼠的骨小梁表现出显著增生（图1f–j）。卵巢切除Dcstamp-tail−/−小鼠的骨量也得到了显著改善（图1f–j ）。这些结果表明，DCSTAMP结构域的破坏会损害其功能，从而导致骨量增加。

图1 DCSTAMP 结构域的破坏可导致小鼠骨量增加

作者评估了DCSTAMP结构域缺失对破骨细胞、成骨细胞和内皮细胞的影响。TRAP染色显示，Dcstamp-tail−/−小鼠体内破骨细胞数量减少（图2a，b）。卵巢切除（OVX）也诱导Dcstamp-tail −/−小鼠中破骨细胞数量显著减少（图2a，b）。虽然 OVX 增强了 WT 细胞中成熟破骨细胞的形成，但 Dcstamp-tail −/− mBMM 在假手术和 OVX 条件下均表现出成熟破骨细胞形成受抑制（图2c、d、g、h）。骨形态学分析显示，OVX降低了WT小鼠的成骨细胞数量，但Dcstamp-tail −/−小鼠在假手术组和OVX组中均保持较高细胞数（图2e，i）。Dcstamp-tail敲除显著逆转了OVX引起的骨形成率/骨形成面积比（BFR/BS）和骨形成率（MAR）降低（图2f，j ）。Dcstamp-tail −/−小鼠的内皮细胞数量增加（图2k-n）。Dcstamp-tail −/−小鼠骨髓中 PDGFBB 水平显著升高（图2o）。这些结果表明，Dcstamp-tail敲除抑制了破骨细胞生成和骨吸收，同时通过调节骨微环境间接增强骨形成和type H血管发育。

图2 Dcstamp tail−/−小鼠表现出骨吸收减少，同时骨骼和血管形成增强

利用AlphaFold3预测了DCSTAMP蛋白结构（图3a）。进一步分析显示，人和小鼠DCSTAMP序列显示其高度保守，并将结构域位置和潜在活性位点（红色高亮显示）进行了标注（图3g）。为了筛选潜在的DCSTAMP拮抗剂，基于Drugbank和Enamine化合物库进行了全面的分子对接虚拟筛选，最终筛选出5个化合物（图3i）。只有 Z2371498431在浓度高达 10 μM 时，对破骨细胞生成表现出显著抑制作用，且对小鼠骨髓巨噬细胞无细胞毒性（图3i –k）。因此，来自 Enamine 化合物库的 Z2371498431 被命名为 E8431，作为一种新型 DCSTAMP 拮抗剂进行进一步研究。

图3 DCSTAMP 拮抗剂的虚拟筛选和实验验证

柔性分子对接分析显示，E8431 与人源和鼠源 DCSTAMP 蛋白的结合能分别为-10.4 kcal/mol 和 -10.1 kcal/mol（图4a、b）。此外，DCSTAMP尾部结构域的缺失消除了 E8431 与DCSTAMP 的分子相互作用（图4c）。利用小鼠骨髓单核细胞（mBMMs）进行体外实验，评估E8431对破骨细胞的影响。TRAP染色结果显示，E8431呈剂量依赖性地抑制成熟破骨细胞生成，其中2 μM E8431的抑制效果最佳（图4d，h）。E8431减少了功能性破骨细胞的数量，表现为肌动蛋白环减少（图4e，i）。破骨细胞融合实验表明，破骨细胞前体膜融合率显著降低；E8431处理后破骨细胞的骨吸收面积减少（图4f，g，j，k）。成熟破骨细胞特异性标志物（Oscar和Ctsk）在所有浓度下均呈显著下调表达（图4l）。这些研究结果表明，E8431通过与DCSTAMP蛋白结合抑制破骨细胞融合和吸收。

图4 DCSTAMP 拮抗剂在体外抑制破骨细胞前体融合和骨吸收

为了探究E8431对血管生成的影响，建立了一个包含间充质干细胞/小鼠原代内皮祖细胞（mEPCs）和破骨细胞的共培养系统（图5a）。E8431处理后PDGFBB表达显著升高（图5b）。E8431处理显著增强了mEPC迁移能力（图5c-f），促进了mEPC管状结构形成（图5g，h）。此外，在共培养系统中引入 PDGFBB中和抗体则完全消除了 E8431 在体外介导的促血管生成作用（图5a-h）。

利用Transwell小室建立了共培养系统，将mBMMs和mBMSCs分别接种于上室和下室（图5i）。共培养组的ALP活性显著增强，E8431处理显著增强了这种效应（图5j，l），且显著提高了OCN表达（图5k，m）。成骨标志基因，包括Runx2、ALP和Bglap，在E8431处理组中也显著上调表达（图5n）。此外，将 PDGFBB 中和抗体加入共培养体系中，完全消除了 E8431 在体外赋予的促骨形成作用（图5i-n）。这些研究结果表明，E8431 通过保存破骨细胞前体并随后激活 PDGFBB 介导的 PI3K–FAK 信号转导来增强 hBMSC 成骨作用。

图5 DCSTAMP 拮抗剂通过抑制PDGFBB 分泌来增强成骨和血管生成

卵巢切除小鼠经E8431治疗6周后，完全逆转了OVX引起的骨丢失（图6a-c）。E8431治疗使OVX降低的骨小梁面积恢复至与假手术组相当的水平（图6d, e）。E8431使骨转换相关的血清标志物（包括CTX-1和PINP）表达恢复正常，表明其对成骨和破骨细胞生成具有双重调节作用（图6f, g）。E8431减少了TRAP阳性多核细胞（成熟破骨细胞），同时增加了TRAP阳性单核细胞（前破骨细胞）（图6h，i）。E8431治疗后OCN阳性细胞数显著增加（图6j，k）。E8431恢复了OVX抑制的骨形成率（图6l，m）。E8431治疗后OVX诱导的H型内皮细胞减少得到了恢复（图6n-p，r）。E8431 治疗后小鼠骨髓 PDGFBB 表达显著升高（图6q）。这些结果表明 E8431 是一种治疗骨质疏松症的潜在药物。

图6 DCSTAMP 拮抗剂可减轻小鼠因雌激素缺乏引起的骨质流失

进一步研究了E8431的分子机制。从WT、Dcstamp-tail −/−和E843+WT小鼠中分离mBMMs，进行RNA测序。Dcstamp-tail −/−组和 E8431 组中关键破骨细胞基因均表现出下调，包括 Ctsk、Dcstamp、Car2、Mmp9、Atp6v1b2、Oscar、Mmp14 和Ocstamp等（图7b）。在 Dcstamp-tail −/−组中，重叠的下调基因约占所有下调基因的 50%，而在 E8431 处理组中，这一比例约为三分之二，表明存在显著的机制趋同性（图7c）。相比之下，上调基因在 Dcstamp-tail −/−组和 E8431 处理组之间的一致性较低（图7d）。

随后对Dcstamp-tail −/−组和E8431处理组之间共同下调基因进行了富集分析。GO分析显示，这些基因在骨重塑、骨吸收、GTP酶介导的信号转导、肌动蛋白丝相关过程中显著富集（图7e）。KEGG通路分析发现，Rap1信号通路显著富集（图7f）。GSEA分析也表明Rap1信号通路显著下调（图7g）。WT组中RAP1、RAC1及Syk和Src的磷酸化水平显著升高；而Dcstamp-tail敲除和E8431处理均显著减弱了这些效应（图7h，i）。利用 Rap1 激动剂 8-CPT-2′-O-Me-cAMP 进行挽救实验，部分挽救了Dcstamp-tail敲除和 E8431 处理下观察到的成熟破骨细胞形成受损（图7j–n）。这些发现证实 RAP1–RAC1 信号通路及其相关的细胞骨架重塑是 DCSTAMP 介导信号通路的关键下游效应因子。

图7 干扰 DCSTAMP 功能会导致破骨细胞生成过程中 RAP1–RAC1 信号通路的抑制

为了阐明 DCSTAMP 调控 RAP1–RAC1的机制，使用 DCSTAMP 抗体在WT和 Dcstamp-tail −/−细胞裂解液中进行了Co-IP实验（图8a）。值得注意的是，在WT中检测到了 RAP1B，但在 Dcstamp-tail −/−中未检测到，表明 RAP1B 可能直接调控 RAP1–RAC1 信号通路（图8a，b）。尽管RAP1A与DCSTAMP或RAP1B均无相互作用，但RAP1B在野生型条件下与DCSTAMP表现出强烈的结合，而Dcstamp-tail 敲除和E8431处理均显著降低了这种结合（图8c）。使用RAP1A抗体进行的反向共免疫沉淀实验证实了RAP1A与DCSTAMP和RAP1B均无相互作用，而RAP1B免疫共沉淀验证了其与DCSTAMP的直接相互作用（图8d，e）。此外，与DCSTAMP结合的RAP1表现出显著激活，这种激活被Dcstamp-tail敲除完全消除，并被E8431处理显著降低（图8f）。分子对接分析揭示了 RAP1B 与 DCSTAMP结构域的相互作用（图8g）。预测 E8431 会占据 DCSTAMP 的活性位点，该位点位于这两个蛋白的界面处，并可能破坏它们的相互作用（图8h）。综上所述，这些结果表明 DCSTAMP 通过直接结合RAP1B 来激活下游 RAP1-RAC1 信号通路，而 DCSTAMP结构域的缺失或 E8431 处理均可有效抑制这一过程（图8i）。

图8 DCSTAMP 拮抗剂阻碍 DCSTAMP 与 RAP1B的相互作用，从而抑制细胞骨架重塑和破骨细胞生成