Nature neuroscience | 解析人体脊髓胚胎发育之谜

图1发育中的人类脊髓时空图谱

图2 脊髓神经细胞的异质性

为了描述 NPC的 分化特征，从 scRNA-seq中选择了NPC 和神经元细胞群进行拟时序分析。Slingshot 揭示了NPC分化为多个神经元细胞，每个分支都有特定的基因表达（图 3a,b）。通过NPC（DCC 和 GADD45G）、神经元谱系相关基因（ExNs 中的 CACNA2D1、IbNs 中的 NRXN3 和 ChNs 中的 NEFL）和神经元基因（ExNs 中的 KCNIP4、IbNs 中的 ROBO3 和 ChNs 中的 SLC5A7）的表达，HybISS进一步验证了轨迹结果（图 3b）。整合了 scRNA-seq 轨迹和 ST 数据，结果显示 hNPCs 首先分化为 INPs，然后分化为不同的功能神经元（图 3c）。其中EBF1（ExNs）、PAX2（IbNs）和 SLC5A7（ChNs），在 ST中表现出偏向 DV 的表达，这与分化神经元类型的定位相关（图 3d）。PBX3 与所有三个神经元系都有关联，因此没有表现出特定 DV 模式（图 3d）。

对胶质细胞进行了类似的分析，结果表明所有三个胶质细胞系都起源于一个共同的 NPC 亚型，并具有特定的分支相关基因（例如 EPC 的 CNTNAP5、ASC 的 MSX1 和 OPC 的 HES6）（图 3e）。在空间上，这些基因与新生神经胶质细胞在同一区域表达（图 3f）。综合轨迹和 ST 数据显示，hNPCs 以特定的空间模式分化为神经胶质细胞--脊髓背侧为 ASCs，脊髓中央为 EPCs，脊髓腹侧为 OPCs 和 OLs（图 3g）。

图3神经细胞和胶质细胞分化发育的时空调控

为了更好地理解沿 DV 轴的调控（如 TFs、信号通路和细胞-细胞相互作用），首先分析了神经相关的信号通路，发现大多数细胞类型都表达WNT、NOTCH 和 SHH的相关基因，但随着时间的推移而减少（图 4b）。IHC 证实，在W5时active-β-catenin (ABC)和 SHH 通路分子（SHH、GLI1 和 GLI3）显著表达，但 W8 后表达明显减少（图 4c）。

Progenitors相关基因在 W5 阶段表现出 DV 偏向表达，而Neurons相关基因在 W5-8 阶段表现出 DV 偏向表达（图 4e）。细胞共定位结果表明，NPC 的比例明显下降；在W5时，NPC分化为神经元和前神经胶质细胞；而在W8时，neurogenesis和gliogenesis细胞开始发生迁移（图4f）。

图4 人类脊髓发育的调控网络

为了探讨低增殖的人NPC是否是一种特殊表型，将 scRNA-seq与两个小鼠脊髓发育数据集进行了整合分析（图 5a）。从 W5 到 W7，大多数 hNPCs 的增殖标记物 MKI67 和 TOP2A 表达量较低，与此形成鲜明对比的是，小鼠 NPCs（mNPCs）至少在胚胎 13.5 天（相当于人类的 W7 天）前增殖能力很强（图 5b）。IHC 显示，在 W5 人类脊髓中，许多 SOX9+ hNPCs 不表达 Ki-67，这与小鼠 E10.5 脊髓中大部分 Sox9+Ki-67+ 细胞不同。这证实，与 mNPCs 不同，大多数 hNPCs 在发育早期就进入了静止期（图 5c）。

在人鼠整合 scRNA-seq 数据集中，我们发现 MSX1、GFAP在人ASCs 中确实高表达，但在小鼠的 ASCs 中却低表达（图 5d）。相反，MSX1 和 FOXJ1 在小鼠和人类Ependymal 中均有表达，这表明 MSX1 在调节人类 ASC 和 EPC 的细胞命运过程中具有双重作用，但在小鼠中只调节 EPC。对人（W8）和小鼠（E16）脊髓切片在相似时间点的 ST 分析验证了 MSX1 在人中的表达主要位于背侧心室区，与 ASCs 中 GFAP 和 EPCs 中 FOXJ1 的标记基因表达相关（图 5e）。然而，在小鼠切片中，我们发现 Msx1 与 Foxj1+ 细胞在同一区域表达，但不在 Gfap+ 区域表达，这与之前的研究26 显示 Msx1 调控小鼠 EPC 发育的结果一致（图 5e）。总之，这些数据表明，小鼠和人类脊髓发育过程中的时空基因表达存在根本差异。

图5 神经发育过程中的物种特异性

将脊髓肿瘤单细胞数据映射到ST 数据上，发现脊髓肿瘤细胞广泛存在但无区域特异性基因，表明正常人发育中的脊髓中有许多细胞类型与肿瘤有相似之处（图 6a）。将 scRNA-seq与室管膜瘤单细胞转录组数据进行整合分析。尽管神经元和胶质细胞有不同程度的重叠（图 6c、f），但神经元标记基因主要在正常神经元中表达（图 6d），而胶质细胞的标志基因在正常细胞和肿瘤细胞中表达相似（图 6g）。

此外，重点比较了正常细胞和肿瘤细胞的重叠区域，发现了肿瘤特异性基因，如CASC15 和 microRNA MIR99AHG，RPS14 和 RPS8（图 6e,h）。许多 CSC 与正常 NPC 重叠（图 6i），并共同表达经典 NPC 标记 SOX2 和 VIM（图 6j）。发现了 CSC 特异性标记 FTX 和 MIR99AHG，它们在正常 hNPCs 中没有表达，因此可能成为室管膜瘤 CSC 的新治疗靶点（图 6i-k）。

为了进一步研究 hNPC 和 CSC 分化的分子差异进行拟时序轨迹分析，结果表明TF RFX2 和 RFX4与 EPC 分化高度相关（图 6l,m）。NLRP1 和 VWA3B 分别与正常 EPC 和 EPC 样 CSC 的分化特别相关（图 6n）。同样，WLS 和 APOD 分别与 ASC 和 OPC的分化相关（图 6o,p）。

图6 胎儿脊髓与室管膜瘤的关系