『Cell Host&Microbe』联合抗癌！中国药科大学单云龙团队揭示TKIs通过调节肠道菌群增强癌症免疫疗法

肠道微生物作为人体内一个庞大的微生物群落，与人类健康息息相关。肠道微生物通过与免疫系统和肿瘤微环境的相互作用，对抗肿瘤免疫和免疫检查点阻断（ICB）疗效有深远影响，但其具体机制尚不明确。本文分享一篇发表在Cell Host&Microbe 期刊上的文章，题为：Microbiota-derived urocanic acid triggered by tyrosine kinase inhibitors potentiates cancer immunotherapy efficacy，揭示了酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）如何通过调节肠道微生物群增强免疫检查点阻断（ICB）疗法的疗效。

免疫检查点抑制剂（ICB，如抗PD-1抗体）仅对约10%-30%的实体瘤患者有效，且部分患者易复发。近年研究表明，酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）与ICB联用可提升疗效，但一些癌症患者对联合治疗的响应率仍然很低，其潜在的机制尚不清楚。肠道微生物群已被证实可通过调节肿瘤微环境（TME）影响ICB疗效，然而，具体哪些肠道微生物或其代谢物介导这一过程尚未明确。前期研究表明，TKIs可改变肠道菌群组成，但具体机制及关键效应分子尚未阐明。因此，本研究聚焦于TKIs如何通过微生物代谢物重塑TME，以揭示其对ICB的增敏作用。

为了研究接受TKI治疗的癌症患者的肠道微生物代谢物是否具有抗癌作用，作者将TKI治疗14天后无腹泻的患者粪便中提取的代谢物加入到偶氮氧甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠癌小鼠的饮用水中(Figure 1A)，发现用肠道微生物代谢物处理的小鼠表现出明显的肿瘤抑制(Figure 1B-1E)，在MC38异种移植模型中也出现了同样的结果。

为了进一步鉴定TKIs触发的微生物代谢物是否能促进抗肿瘤免疫，作者进行了流式细胞术分析，结果显示在肠道微生物代谢物组中，总CD8+ T细胞和活化CD8+ T细胞显著增加，同时MDSCs减少(Figure 1H-1J和S1D-S1F)。此外，肠道微生物代谢物并未抑制免疫缺陷小鼠的肿瘤生长。以上结果表明：TKI触发的肠道微生物代谢物可能具有抗肿瘤作用，并可能通过抑制MDSC募集来促进抗肿瘤免疫。并且进一步的实验结果表明TKI诱导的代谢物依赖于微生物群，并调节MDSC的募集和CD8+ T细胞的激活。

Figure 1. TKIs触发的肠道微生物代谢物重塑了TME

为了鉴定可能重塑TME的肠道微生物代谢物，作者对接受或未接受TKI治疗的小鼠的肠道内容物和等离子体进行了代谢组学分析，与预处理组相比，治疗组的UCA相对水平显著升高(Figure 2C和S2C)。且在TKI 治疗后，水处理小鼠的粪便和血清中的UCA浓度升高。然而，在ABX处理的小鼠中，TKI对UCA积累的影响被消除(Figure 2E)。这些结果表明TKI引发的UCA增加可能依赖于微生物群。为了评估TKIs对患者UCA积累的影响，作者观察到，TKI处理组(T)与未处理组(NT)相比，粪便和血清中的UCA浓度均显著升高(Figure 2G)。此外，代谢谱显示了TKI治疗后UCA上游和下游代谢物的变化。这些结果表明，TKIs强烈地触发微生物源性UCA的产生。

为了了解UCA对体内抗肿瘤作用的潜在贡献，水或ABX处理的小鼠通过饮用水给予UCA(Figure 2H)，作者发现给予UCA可诱导更强的肿瘤抑制，延长生存期，增加UCA浓度，并且MDSC招募减少，T细胞浸润和活化增加。作者进一步证明，UCA不会诱导肝脏或肠道损伤，也不能直接抑制体内和体外肿瘤的生长，且对CD8+ T细胞的增殖或激活也没有影响。共培养实验显示，UCA和其他物质不影响MDSCs对CD8+ T细胞的抑制作用。这些发现表明，UCA的抗肿瘤作用可能是通过抑制MDSC向TME募集而不是直接靶向肿瘤细胞或免疫细胞来介导的。为了进一步证实MDSCs在UCA肿瘤抑制作用中的作用，作者使用Gr-1单克隆抗体(mAb)进行了体内MDSC消耗实验(Figure 2P)。结果发现UCA的肿瘤抑制作用被消除(Figure 2Q)。这些结果最终表明，UCA的肿瘤抑制作用是通过减少MDSC向TME的募集来介导的。

Figure 2. 微生物源性UCA优先抑制MDSCs的募集

为了更好地了解TKI治疗对结直肠癌患者肠道微生物群的调节作用，并确定有助于UCA产生的微生物类群，作者对结直肠癌患者和接受或不接受TKI治疗的小鼠的粪便进行了测序，发现Muribaculaceae在不同的微生物群中表现出更高的丰度(figure3B-3D)，接受TKI治疗的癌症患者显示其肠道微生物群中Muribaculum显著扩大(figure3E)。此外，TKI治疗后小鼠Muribaculum的丰度随着治疗天数的增加而逐渐增加(figure3F)。为了鉴定和验证TKI治疗后与UCA产生相关的肠道微生物群，作者进行了选择性抗生素耗竭实验，结果表明UCA主要来源于革兰氏阴性厌氧菌(figure3G)，并且发现Muribaculum可能是UCA的主要生产者。

为了研究M. gordoncarteri是否能发挥与UCA相似的抗肿瘤活性，作者将M. gordoncarteri每周灌胃3次(figure3I)。观察到与对照培养基(CM)或大肠杆菌组相比，M. gordoncarteri组Muribaculum丰度升高，肿瘤体积减小(figure3J和S3L)，UCA水平显著提高，MDSC浸润减少，总CD8+ T细胞和活化CD8+ T细胞数量均显著增加(figure3K-3M)。这表明M. gordoncarteri促进免疫抑制性TME向免疫活性状态的进行性转变。接下来作者构建表达Muribaculum hutH基因的工程化大肠杆菌（hutH+ E. coli），证实其能独立产生UCA，并显著抑制肿瘤生长，降低MDSC浸润，增强CD8+ T细胞活性。而后又构建一个hutU+大肠杆菌菌株（消耗UCA），发现免疫抑制微环境效应的改善被hutU+大肠杆菌所消除。宏基因组分析显示，TKI组hutH相对丰度显著增加，而hutU丰度无显著差异，且TKI显著促进M. gordoncarteri的生长。以上结果揭示了TKIs对微生物群落的协同作用，其中UCA主要来自Muribaculum。

Figure 3. UCA源于Muribaculum对TKI治疗的反应

为了阐明UCA如何改善肿瘤内免疫环境，作者对接受或不接受UCA治疗的小鼠肿瘤进行了单细胞RNA测序(scRNAseq)分析，结果揭示了十种主要的细胞类型(figure4C和S4D)。值得注意的是，UCA使MDSCs的比例从15.23%降低到7.17%，但增加了肿瘤中CD8+ T细胞的浸润(figure4C)。进一步的细胞间通讯网络分析结果显示MDSCs与基质细胞(包括肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞)之间的相互作用(figure4F)。UCA治疗减少了MDSC向肿瘤的募集，不影响Cxcl2在成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤细胞中的表达，但降低了内皮细胞中Cxcl1在总肿瘤中的丰度。伪时间分析的比较证实，UCA组TECs的Cxcl1水平低于对照组(figure4J和4K)。这些数据表明UCA可以通过内皮细胞CXCL1调节TEC-MDSC的通讯。

Figure 4. UCA通过内皮细胞CXCL1调节TEC-MDSC之间的通讯

为了进一步探讨UCA是否靶向TECs，作者使用LC-MS/ MS测量了TECs和肿瘤细胞中的细胞内UCA浓度。发现总肿瘤组织和TECs中的UCA水平明显高于非内皮细胞(figure5A)。在离体TECs中，Cxcl1的相对水平被UCA显著降低，并与UCA浓度呈负相关(figure5B)，且UCA显著降低了CXCR2+ MDSCs的频率，并与肿瘤中UCA浓度呈负相关。并且TEC_UCA组通过transwell膜迁移的MDSCs明显减少，抗CXCL1抗体治疗显著降低了MDSC的趋化性(figure5D)。因此，CXCL1-CXCR2轴在TEC-MDSC通信中起着至关重要的作用，UCA治疗在TECs中严重损害了该轴。

为了研究UCA抑制内皮细胞CXCL1表达的机制，作者对内皮细胞进行了GSEA分析，结果显示，与vehicle组相比，UCA组的TECs中NF-κB标志基因集和NF-κB通路下游靶点下调(figure5E和5F)，这表明UCA可能通过使NF-κB通路失活来降低CXCL1的表达。UCA抑制p65核易位，降低p65和IκBα的磷酸化(figure5I-5K)。作为IκBα磷酸化抑制剂BAY11-7085，增强了UCA对IκBα磷酸化的抑制作用(figure5L)。UCA降低了IκBα的磷酸化和随后的CXCL1分泌，而这种表型被核因子κB激酶亚单位β (IKKβ)过表达抑制剂显著挽救(figure5M)。综上所述，这些结果表明UCA是一种有效的IκBα磷酸化抑制剂，可以降低内皮细胞CXCL1的表达。

Figure 5. UCA通过使内皮细胞NF-κB通路失活来抑制MDSC募集

为了确定与NF-κB通路相关的UCA的潜在靶点，作者合成了生物素-UCA探针，并且拉到一个特异性条带，PMF 分析显示该蛋白是IκBα。免疫荧光染色进一步显示生物素-UCA在HUVECs细胞质中与IκBα共定位。此外，与DMSO相比，UCA显著增强了IκBα的热稳定性。这些结果表明UCA可以有效和特异性地与IκBα相互作用。为了进一步研究UCA对IκBα的特异性结合位点，作者将重组IκBα蛋白和含与不含UCA组孵育，LC-MS/MS分析结果显示含有Asp31位点的IκBα肽的质量变化了138.04 Da(figure6A)，即一个UCA 分子的大小，表明UCA可以对Asp31残基进行共价修饰。随后的MST 实验证明UCA和IκBα^WT具有较高的结合亲和力(figure6B)。IP 和pull-down 实验结果进一步证实了UCA修饰了IκBα的Asp31位点(figure6C和6D)。后续的分子动力学（MD）模拟等实验发现UCA通过修饰IκBα Asp31残基直接抑制IκBα Ser32的磷酸化。

Figure 6. UCA直接靶向IκBα，选择性抑制Ser32残基的磷酸化

接下来，作者测试了UCA是否足以增强ICB治疗CRC模型的疗效。与先前的结果一致，单独给药UCA可以抑制AOM/DSS小鼠的肿瘤，且发现UCA显著促进了抗PD-L1抗体的抗肿瘤作用(figure7A-7D)。联合UCA和抗PD-L1治疗导致肿瘤中CD8+T细胞和干扰素(IFN)-γ+CD8+ T细胞的积累更为显著(figure7J和7K)。在联合治疗模型中，UCA浓度与肿瘤中MDSCs或CXCR2+ MDSCs的频率一致呈负相关(figure7M)。接着作者通过在hPD-L1/hPD-1人源化小鼠模型中触发UCA来研究TKIs对ICB的增强作用，TKI联合抗人PD-1抗体显著降低MDSC募集(figure7P)，增加肿瘤内T细胞增殖和浸润(figure7Q和S7K)。此外，TKI治疗后观察到UCA浓度增加(figureS7L)。这些结果表明，TKI触发的UCA导致MDSC募集减少和随后的T细胞活化，可以增强抗PD-L1治疗的反应性。

Figure 7. M.gordoncarteri来源的UCA促进CRC小鼠模型的免疫治疗反应并预测患者预后

为了证实UCA与抗PD-L1治疗反应的临床相关性，作者收集了抗PD-L1治疗的癌症患者的粪便和血清。应答者比无应答者检测到更高的UCA和M. gordoncarteri水平(figure7R和7S)。此外，具有更高丰度的M. gordoncarteri 和UCA患者表现出更长的总生存期(figure7T)。UCA和M. gordoncarteri的丰度与MDSC密度和内皮细胞核p65+呈负相关，而与CD8+ T细胞百分比呈正相关(figure7W)。总之，这些结果表明UCA、M. gordoncarteri和内皮特异性标志物的丰度与临床相关，可以作为CRC患者对ICB免疫治疗反应的预测因子。

在人类结直肠癌中，特征突变包括致癌KRAS突变，主要是KRAS^G12D，以及APC和TP53的失活。作者建立了MC38细胞模型，包含三个基因单点突变（TP53基因KO、APC基因KO、KRAS^G12D基因KI），双点基因突变及三基因同时突变；作者发现除PAK突变体对TKI具有抗性外，其余突变体均被TKI抑制，且MDSCs减少，活化的CD8+ T细胞增加(figureS7P-S7R)。此外，UCA和Muribaculum水平在大多数突变体中升高(figureS7S)。这些发现部分提示UCA和Muribaculum也可能具有抗肿瘤作用，并预测其他基因型CRC对ICB的免疫治疗反应。

酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）通过促进肠道中Muribaculum菌群增殖并增加其代谢产物尿刊酸（UCA），UCA与内皮细胞中的IkBα结合抑制NF-κB信号通路，减少CXCL1介导的髓源性抑制细胞（MDSC）浸润，从而增强了抗PD-1免疫治疗效果。