肿瘤微环境研究综述

2023年1月30日，荷兰癌症研究院在Nat Rev Cancer上发表了一篇“Mechanisms driving the immunoregulatory function of cancer cells”的文章。癌症细胞的内在特征通常是由遗传和表观遗传变异、信号传导失控或代谢改变驱动的，为癌症细胞提供了生长和生存优势。癌细胞固有程序还通过分泌组、细胞与细胞的直接接触、细胞外囊泡的形成和运输或营养物质的可用性影响与免疫系统的通信。作者讨论了癌细胞内在机制如何协调肿瘤免疫微环境，以及这些机制如何导致肿瘤之间免疫环境的多样性、影响免疫逃避以及影响对癌症免疫治疗的反应。

此外，2024年2月在Nat Rev Cancer杂志上也发表了一篇关于肿瘤微环境非遗传因素驱动癌症的综述（Beyond genetics: driving cancer with the tumour microenvironment behind the wheel）。首先对肿瘤微环境（TME）中驱动恶性肿瘤的细胞外因素进行了介绍，包括：转化细胞与周围健康组织间的竞争、炎症对肿瘤发生的促进作用、间质成纤维细胞对癌症的驱动、微环境中的机械力以及血管淋巴管和神经新生对癌症的影响。第二部分介绍了细胞固有的非遗传因素对癌症的驱动作用，包括TME诱导的转录因子失调、染色质动力学的影响及癌症进展的转录后调控。文章全面的总结了驱动肿瘤的非遗传因素，提出癌变和肿瘤进展的过程可以看作是遗传和非遗传因素之间的动态平衡，这种平衡是为适应癌细胞起源及肿瘤进展过程中不断变化的微环境而量身定制的。

空间转录组技术

肿瘤微环境的异质性是阻碍抗癌治疗成功的核心问题之一。了解TME组装的空间结构对于发现肿瘤发生机制和设计新的治疗策略至关重要。空间转录组(spatial transcription)的出现为高通量测序加上了空间的坐标信息，为神经科学、发育学、植物学、病理学等领域提供了强有力的研究手段。

 

空间转录组主要有两种策略：

（1）基于NGS的策略，这一策略的核心思想是给不同位置来源的reads带上具有空间信息的短序列(空间barcode/ID)（代表性技术如10x Visium、10x CytAssist、10x Xenium、10x Visium HD、华大Stereo-seq等）；

（2）基于图像(Image)的策略，这一策略主要为原位扩增+原位测序、原位杂交（代表性技术如SeqFISH、MERFISH等）。

无论是那种策略，最终目的都是得到带有坐标信息的基因矩阵，再加上分组中设置的时间关系，甚至可以得到时空转录组数据。

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基于NGS策略的空间组学技术

基于NGS策略的空间组学技术可进一步分为固相转录组捕获（Solid-phase transcriptome capture）技术和确定性空间条形码（Deterministic spatial barcoding ）技术,其中前者捕获范围大，获取的信息更多。随着技术更迭，空间分辨率在逐步提升。

下面介绍几个代表性的固相转录组捕获技术：

1）10x Visium

作为当前广泛应用的Visium技术的前身，其核心原理是将空间条形码寡核苷酸引物固定在载玻片上，然后将组织贴于载玻片实现组织内转录组序列的捕获与检测。每个Visium捕获区域面积为6.5mm×6.5mm，包含约5000个直径为55μm的Spots（spot圆心之间的距离为100μm）。

2）10x CytAssist

基于CytAssist仪器进行检测，可根据组织大小进行灵活选用（6.5mm×6.5mm 或11mm×11mm）。Visium平台还支持FFPE样本的检测，极大提升了Visium技术的可及性。

3）10x Visium HD

采用2 μm的方形连续网格图案，彼此之间没有间隙，大大提升了信号密度，可以实现单细胞的分辨率。Visium HD包含了6.5 x 6.5 mm捕获区域，以2 x 2 µm为检测单元，实现单细胞级的空间分辨率。推荐以8 x 8 µm作为可视化和分析单元。

4）华大Stereo-seq

在DNA纳米球（DNBs）上进行原位RNA捕获，通过滚环扩增（RCA）产生随机条形码序列并加载到芯片表面，Spot大小约为220nm，可产生亚细胞级转录图谱。

 

各个平台技术参数比较如下：

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空间组转录组数据分析内容

有很多能够分析空转数据的工具包，例如Giotto、Seurat、STUtility、STLearn等。在测序质量方面，除了做定量时可以观察信噪比，对于不同spots捕获到的转录本数量也可以一定程度上反应测序质量与批次效应。而在许多空间转录组可以达到亚细胞分辨率的现在，如何将spots划分到不同的细胞中也成为了一种“幸福的烦恼”。

 

下面进行详细介绍：

1）Spot cluster聚类

单细胞中的降维方法如PCA、tSNE、UMAP等依旧可以用于spots聚类。还有一些更复杂的矩阵分析方法，例如共表达模块分析、非负矩阵分解、因子分析等依然可以用于识别特定的细胞cluster。但在空转数据中，除了考虑细胞/spots之间的表达相似程度外，还需要考虑在空间中是否相邻或连续。

2）Select 模块分析

像单细胞中提取特定亚群进行分析，空间转录组也可以选取特定的模块进行分析，如恶性组织的边缘就是一个很值得关注的区域。当然，选择特定的基因观察其是否具有特定的空间分布也是一种思路，如利用BinSpect进行临近富集分析、利用Haystack进行熵值计算、利用SpatialDE或SPARK进行高斯回归计算都是不错的尝试。

3）基因集评分分析（Score）

针对对一些特定基因集进行生物学意义的探寻，很多基因集评分方法（如AddModuleScore、ssGSEA、GSVA、AUCell等）都可以用。

4）细胞类型鉴定（Characterize）

对细胞类型的鉴别一直是一个难题，除了单纯看marker基因表达外，富集分析(如GSEA、KEGG、GO等)也是很好的方法。此外，对spot所属细胞类型的鉴定也有很多策略，通过使用scRNA-seq 数据的细胞类型特异性基因表达信息对空间转录组学数据进行反卷积（如MuSiC、RCTD、SPOTlight、Cell2location、SpatialDWLS、Stereoscope、CARD等），推断每个空间位置的细胞类型组成。

5）其他分析

在单细胞中常用到的分析如拟时序分析、细胞通讯分析等也都可以在空间转录组数据中进行计算。

6）联合分析

一些组织病理学相关的机器学习方法可以与空间转录组联合分析，或是一些DNA seqFISH、RNA seqFISH等杂交技术亦可以与空间转录组相互佐证。多重免疫荧光（Multiplexed Immunofluorescence）, 超多蛋白检测平台 (CODEX，CO-Detection by IndEXing)、t-cyCIF等空间蛋白高通量检测技术与空间转录组也能形成很好的互补。

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样本收集

1）OCT包埋冰冻组织/白片/切片

制备 OCT包埋冰冻组织块，建议组织大小为长×宽不超过 6.5mm×6.5mm，高度≥5mm；白片或贴片建议准备6-13 片（10μm 厚度）。封装好用干冰进行寄送。

2）FFPE包埋组织/白片/切片

石蜡包埋组织封装好后，4℃进行寄送。

石蜡包埋白片或贴片建议准备6-13 片（5μm 厚度），4℃进行寄送。

参考文献

【1】van Weverwijk A, de Visser KE. Mechanisms driving the immunoregulatory function of cancer cells. Nat Rev Cancer. 2023 Apr;23(4):193-215. doi: 10.1038/s41568-022-00544-4. Epub 2023 Jan 30. PMID: 36717668.

【2】Yuan S, Almagro J, Fuchs E. Beyond genetics: driving cancer with the tumour microenvironment behind the wheel. Nat Rev Cancer. 2024 Apr;24(4):274-286. doi: 10.1038/s41568-023-00660-9. Epub 2024 Feb 12. PMID: 38347101.

【3】Rao A, Barkley D, França GS, Yanai I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 2021 Aug;596(7871):211-220. doi: 10.1038/s41586-021-03634-9. Epub 2021 Aug 11. PMID: 34381231;

【4】Moffitt JR, Lundberg E, Heyn H. The emerging landscape of spatial profiling technologies. Nat Rev Genet. 2022 Dec;23(12):741-759. doi: 10.1038/s41576-022-00515-3. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35859028.

【5】Ma Y, Zhou X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 2022 Sep;40(9):1349-1359. doi: 10.1038/s41587-022-01273-7. Epub 2022 May 2. PMID: 35501392.