病毒是由核酸分子（RNA 或 DNA）和 / 或蛋白质组成的非细胞形态，这是一种无法独立生长的生命体，其复制过程必须通过感染宿主细胞，将遗传物质导入宿主细胞，并依靠宿主细胞进行复制，组装成病毒颗粒。对病毒的研究可以分为「抗病毒」和「利用病毒」两种思路，而病毒载体正是「利用病毒」的思路。二十世纪七十年代，分子生物学家 Paul Berg 利用病毒的这一特性，改造 SV40 病毒感染猴子肾脏的培养细胞，做成第一个病毒载体。后来，科学家们开始从利用自然界中存在的病毒获得重组载体的机会，转向合理地设计定制的病毒载体。在过去的几十年里，我们见证了病毒工具化的不断增加，这些病毒已经逐步发展成为广泛应用的高效基因转移载体。

作为一种常用的基因操作工具，常用病毒载体至少具备以下特点：
① 安全性高：虽然有些病毒载体来源于致病性病毒，但通过人们的改造，这些病毒中负责复制和组装的基因被人为删除，这样能够保证病毒载体只能有效感染细胞，而不能继续复制，这为病毒的应用提供了安全性。
② 毒性低：在病毒载体的制备过程中，借助纯化工艺去除杂质后，病毒载体对于被感染细胞的生理功能的影响很小。
③ 含标记基因：病毒载体中一般包含几类用于筛选的特殊基因，包括抗性基因、荧光蛋白基因等，标记基因的存在能够帮助人们确认病毒感染效率、筛选稳转细胞株等。

上述特点都是常用病毒载体的共同特征，但根据科研目标的不同，我们常选择不同病毒载体进行研究。

在对中枢神经系统的研究中，病毒载体因其独特的基因传递特征和靶向特异性，不仅被用来提高我们对基础神经生物学的理解，而且也被用来研究疾病或作为基因治疗载体。腺相关病毒（rAAV）载体和慢病毒（LV）载体是目前啮齿类动物和灵长类动物的中枢神经系统研究和基因治疗临床试验中最常用的载体。
 

了解不同病毒载体的特点能够帮助我们更好地选择研究工具。下文比较了常用 rAAV 和 LV 载体的大小、成分、表达周期、免疫原性等特点差异以及它们在神经科学研究中的应用比较。

重组腺相关病毒 recombination adeno-associated virus, rAAV
腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约 20-26nm，含有 4.7kb 左右的线状单链 DNA 作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型 AAV 基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV 被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。
 

纯化后的 AAV 病毒载体可以用于侵染细胞，侵染细胞时，AAV 与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发 AAV 通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病毒裂解，其单链 DNA 需复制成为双链 DNA 后表达目的基因。
 

rAAV 载体因免疫原性低，宿主细胞范围广，扩散能力强，血清型种类多样等优势，广泛应用于神经系统研究中。它们通常被用于向哺乳动物的大脑输送荧光标记、钙指示剂、和生理操控工具。如基因编码的钙指示剂 (GECIs: GCaMP, jRGECO1)，基因编码的电压指示器 (Voltron, GEVIs: SomArchon)，神经递质探针 (如 DA/Ach/NE/ iGABASnFR) 和光遗传 / 化学遗传元件 (如 ChR2, eNpHR, hM3Dq, hM4Di) 等很容易被包装并通过 AAV 传递。

rAAV 是表达小基因序列的理想载体，借助其，我们可以对细胞内的基因进行操作，包括基因功能获取（Gain of function）和基因功能缺失（Loss of function）。然而，像 spCas9 这样的基因序列太大，无法适应 rAAV 载体。较大的基因偶尔作为分裂模块通过 AAVs 在宿主细胞中重组或使用慢病毒进行传递。

在借助 rAAV 载体进行体内基因传递时，病毒的注射方式、注射体积及血清型的选择都是尤为重要。借助定点注射和整体注射，rAAV 载体能够在大量细胞中广泛表达，中枢神经系统中最常用的包括 rAAV2/1、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9、rAAV2/retro、rAAV2/PHP.eB 等，这些病毒载体对于不同细胞亦有一定的亲和性，在具体研究时需注意不同血清型的选择（和元生物拥有多年 AAV 应用经验，欢迎咨询）。


病毒滴度：rAAV2/1-Cre: 1.13E+13 VG/mL
注射体积：60nl
观察时间：4 周
图片来源：Sci Adv. 2019 Feb 20;5(2):eaat3210. doi: 10.1126/sciadv.aat3210.


病毒滴度：rAAV2/8: 2.45E+12 VG/mL
注射体积：500nl
观察时间：6 周
图片来源：Sci Adv. 2019 Feb 20;5(2):eaat3210. doi: 10.1126/sciadv.aat3210.


病毒载体：rAAV2/retro-syn-EGFP，rAAV2/retro 具有逆行不跨突触特点。


rAAV-PHP.eB 尾静脉注射感染全脑实例
病毒总量：1.5E+11
注射体积：200ul
病毒表达时间：四周

在体外实验中，传统观点认为 rAAV 的效率有限，且感染细胞所需的 MOI 高。但近年来开发出的多种新型 rAAV 载体为我们提供了一些新的思路，如 rAAV-DJ 血清型的 AAV 对于体外培养细胞系的感染效率亦非常可观，这为广大研究者提供了新的思路。


rAAV2/9-hSyn-GFP 感染小鼠原代神经元，病毒转染 7 天后观察 GFP 表达。
图片来源：Curr Protoc Neurosci. 2019 Apr;87(1):e66. doi: 10.1002/cpns.66.

慢病毒 Lentivirus
慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是 RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为 DNA，形成 DNA 整合前复合体，进入细胞核后，DNA 整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录成 mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小 RNA。慢病毒介导的基因表达或小 RNA 干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。



慢病毒载体具有宿主范围广，基因容量大等特点，此外，因其感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，可以达到持久性表达。慢病毒载体在神经生物学研究中的应用不如 rAAV 载体应用广泛，因为其具有一定的免疫原性，且随机整合特性可能导致细胞功能基因的异常。相比较腺相关病毒，慢病毒的扩散范围较小，但其表达更快、基因容量更大（可容纳 4kb），可作为大容量基因的载体。


病毒滴度：LV: 9.98E+8 TU/mL
注射体积：2uL
观察时间：2 周
图片来源：Nat Neurosci. 2017 May;20(5):690-699. doi: 10.1038/nn.4536.


注射体积：1uL
注射速度：100nL/min
观察时间：4 周
图片来源：Mol Psychiatry. 2019 Aug 6. doi: 10.1038/s41380-019-0472-7.

体外应用时，慢病毒载体能够有效地感染培养的神经元、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。由于慢病毒的感染具有整合特性，其能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。


慢病毒载体感染大鼠原代神经元，5uL 病毒量（滴度：1.2E+8 TU/mL）病毒转染 48h 后观察 GFP 表达。
图片来源：Curr Protoc Neurosci. 2019 Apr;87(1):e66. doi: 10.1002/cpns.66.

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参考文献
[1] Curr Opin Virol. 2016 Dec;21:61-66. doi: 10.1016/j.coviro.2016.08.004.
[2] Sci Adv. 2019 Feb 20;5(2):eaat3210. doi: 10.1126/sciadv.aat3210.
[3] Curr Protoc Neurosci. 2019 Apr;87(1):e66. doi: 10.1002/cpns.66.
[4] Nat Neurosci. 2017 May;20(5):690-699. doi: 10.1038/nn.4536. 
[5] Mol Psychiatry. 2019 Aug 6. doi: 10.1038/s41380-019-0472-7.
[6] Curr Protoc Mouse Biol. 2018 Dec;8(4):e58. doi: 10.1002/cpmo.58.
[7] Front Mol Neurosci. 2020 Jul 17;13:129. doi: 10.3389/fnmol.2020.00129.
[8] Curr Protoc Neurosci. 2019 Apr;87(1):e67. doi: 10.1002/cpns.67.