重组腺相关病毒载体（rAAV）介绍及其应用

15957 人阅读发布时间：2020-09-01 17:04

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约 20-26nm，含有 4.7kb 左右的线状单链 DNA 作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型 AAV 基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV 被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。

AAV 基因组结构

rAAV 包装纯化及滴度检测

AAV 包装过程中，包装质粒负责编码目的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作用），辅助质粒包含 AAV 包装所需的cap（编码病毒衣壳蛋白）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒 Helper 质粒。三种质粒共同转染 293T 细胞后，AAV 病毒开始复制和包装。和元上海腺相关病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采用三质粒系统在 293T 细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过 qPCR 对病毒基因拷贝进行滴定。另外，我们也可以根据使用者要求，提供蛋白染色检测衣壳蛋白的完整性以及内毒素含量等。一般情况下 rAAV 的滴度在 10¹²~10¹³VG/ml，完全可以满足各类整体实验的使用要求。

AAV 包装流程图

滴度检测方法：定量 PCR 检测病毒基因组中外源 DNA 拷贝数。
滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链 DNA，外源 DNA 拷贝数代表病毒基因组拷贝数。

rAAV 侵染细胞过程

纯化后的 AAV 病毒载体可以用于侵染细胞，侵染细胞时，AAV 与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发 AAV 通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病毒裂解，其单链 DNA 需复制成为双链 DNA 后表达目的基因。

rAAV 作用机制

rAAV 载体优势

1. 安全性高、免疫原性低：AAV 是一种复制缺陷型 DNA 病毒，无自主复制能力，野生型 AAV 依赖rep 基因进行低频定点整合，rAAV 不整合。目前尚无由 AAV 引起的人类及哺乳动物疾病报道，也是 FDA 批准上市的基因治疗药物中最安全的病毒载体之一。

2. 宿主细胞范围广：AAV 具有广泛的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

3. 扩散能力强：AAV 直径约 20-26nm，体积小，滴度高，具有良好的扩散能力，其中 AAV-PHP.eB 和 AAV9 具有跨血脑屏障的能力，在神经科学领域应用广泛。

4. 体内表达基因时间长：AAV 具有保持长期基因转录表达能力，体内表达一般 3 周可以达到高峰，随后持续高表达，作用时间＞5 个月。

5. 种类多样：AAV 血清型众多，此外，根据不同的实验设计，我们还在不断的突变，筛选新的血清型（AAV1-13，AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…）。

基于上述特点，AAV 被视为是一种高效和安全的体外及体内基因转导工具。尤其在整体水平研究中，与其他常用病毒工具载体相比，AAV 具有感染过程温和长效的表达能力，是基因操作的利器。

rAAV 应用

作为目前最常用的神经系统研究工具之一，rAAV 因其免疫原性低，感染范围广，血清型种类多样，目前已广泛应用于神经系统研究中。

1. 神经环路的结构是大脑工作的基础。为了理解大脑如何行使感觉信息处理、学习和记忆，行为控制等这些复杂的功能，我们必须了解其基本组织结构。因此，对脑区、神经环路和细胞的研究是研究脑科学的第一步。以 AAV 病毒载体作为工具来研究神经网络，既可以在全脑尺度上解析各个脑区之间相互投射关系，也可以在微米尺度描绘出神经元的轴突小结和树突棘等精细形态。不仅可以获得更高分辨率的神经网络的结构。还可以在结构的基础上理解这些神经环路可能的功能。对于特异性操控大脑的神经网络或者表征神经元的活动，可以借助神经元特异性启动子，或是经典遗传组合工具如 Cre/loxP 和 Flp/FRT 等重组酶系统的使用，以实现特定细胞类型的精确靶向。

2. 在标记的基础上，我们可以对细胞内的基因进行操作，常规的基因水平操作手段包括基因功能获取（Gain of function）和基因功能缺失（Loss of function）。涵盖了基因过表达、基因敲除、基因敲低及近年来发展迅速的基因编辑技术（CRISPR/Cas9）等。得益于病毒载体的发展，借助病毒进行基因水平的操作已成为神经科学研究的主流技术。

3. 如果要从神经元或神经环路水平理解行为的神经机制，我们需要操控或观察神经元 / 神经环路的活动，同时检测活动改变与行为的因果关系。近年来，包括光遗传学技术、化学遗传学技术、成像技术等多种新技术的出现完善了生理研究的技术体系，而病毒载体在这些新技术的应用中至关重要。

rAAV 血清型选择

目前已注册的 AAV 种类总数已超过 196 种，灵长类动物体内有 13 种不同血清型的 AAV（即 AAV1-AAV13），其中 AAV2、AAV3、AAV9 源自人类本身，值得注意的是，AAV2 是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的病毒载体。随着研究的不断深入，研究人员发现不同血清型的 AAV 之间可以杂交，而杂交后的 AAV 会兼有杂合双方的特点，因此，AAV 亚型顺势诞生。

现在研究中常用的 rAAV 就是利用 AAV2 型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体，一般标记为 rAAV2/N (N 为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有 AAV2 型的稳定表达和基因整合能力，同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性（不同血清型衣壳表面的特定结构位点决定了各自受体的特异性），表现出一定的器官靶向特异性。

不同血清型 AAV 的组织嗜亲性