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公司新闻/正文
电镜也能“看见颜色”了？尚春峰/刘伟/孔妤团队开启分子特异性成像新视野
11 人阅读发布时间：2026-10-26 10:47
细胞功能由其分子组成与纳米级区室化共同塑造，精密的空间组织构成了从细胞器形态到神经突触传递等生命活动的结构基础。电子显微镜（EM）凭借卓越的超微结构分辨率，一直是解析细胞精细架构的核心工具，但传统电镜本质上是一门“灰度科学”：锇酸、铀盐等重金属染色虽能提供强烈的电子衬度，却难以直接揭示特定分子的身份与分布。荧光蛋白与超分辨光学显微镜能够实现分子特异性标记，但与电镜成像的兼容仍面临挑战，荧光团容易受到强固定及重金属染色条件的影响，而传统电镜标记物如胶体金则存在胞内递送与靶点可及性方面的局限。近年来，基因编码的内源性标记策略为融合分子特异性与超微结构信息提供了新的可能。例如，研究者通过在细胞内原位表达抗坏血酸过氧化物酶APEX2，催化DAB氧化聚合，形成具有电子密度的沉淀，从而在电镜下定位目标蛋白。然而，DAB沉淀与内源性电子致密结构之间的衬度差异有时并不明显，且单一标记体系难以支持多个靶标的区分与同步分析。因此，如何在保留电镜超微结构分辨率的同时，实现对不同分子的特异性识别与多靶标区分，成为细胞生物学与显微成像领域亟待突破的关键问题。
2026年10月，暨南大学尚春峰/深圳北京大学香港科技大学医学中心刘伟/上海交通大学医学院孔妤团队在《Chemical & Biomedical Imaging》发表新研究，突破性地将基因编码的氟沉积与纳米二次离子质谱（nanoSIMS）技术相结合，成功开发出一种全新的彩色电子显微镜成像策略。研究团队利用APEX2催化含氟底物双酚AF（BPAF），在目标蛋白原位生成稳定的氟代酚氧自由基并共价沉积，随后通过nanoSIMS对氟元素进行纳米级质谱成像，首次实现了真正意义上的“彩色电镜”——在接近100 nm的空间分辨率下，同时获取细胞超微结构与多种分子标记的分布信息。这一技术不仅完美兼容常规电镜制样流程，更凭借氟元素在生物体内极低的天然丰度，实现了极高的信噪比与多靶标并行检测能力，为亚细胞分子解剖学开辟了全新维度。
和元生物助力前沿成像技术研究
本研究中，和元生物为研究团队提供了相关分子生物学工具支持，包括pSLenti-CMV-T7 promoter-mito-V5-APEX2-linker-EGFP-3×FLAG-PGK-puro-WPRE质粒、pSLenti-CMV-T7 promoter-LynTag-(GS short)-mGreenLantern-[GGGGS]₃-APEX2-3×FLAG-PGK-puro-WPRE质粒，以及pAAV-hSyn-APEX2-[EAAAK]₆-TUBA1A-WPRE病毒，助力研究团队开展APEX2靶向表达与基因编码氟沉积成像研究。论文作者特别感谢和元生物在本研究中提供的分子生物学支持。
01 技术原理
APEX2催化氟沉积与nanoSIMS质谱成像的协同设计
该研究的核心创新在于将基因编码的酶促反应与高灵敏度的元素成像技术进行了巧妙耦合。在APEX2酶的催化作用下，含氟底物BPAF被氧化为酚氧自由基，这些高反应活性的自由基优先与邻近蛋白质中富含电子的氨基酸残基——包括酪氨酸和色氨酸——发生共价结合，从而将氟元素精准沉积在APEX2所在的微环境中。由于BPAF分子中含有多个氟原子，每一次催化事件都会引入显著的氟信号富集，为后续质谱检测奠定物质基础。
在成像端，研究团队采用nanoSIMS纳米二次离子质谱技术。初级Cs⁺离子束以纳米级分辨率轰击样品表面，逐层溅射剥离表面原子和分子，产生的二次离子（包括¹²C¹⁴N⁻、¹⁹F⁻、³¹P¹²C⁻等）被质量分析器逐一检测。通过不同质量数离子的信号强度比值，研究者可以在同一电镜超薄切片上同时绘制出蛋白质分布（¹²C¹⁴N-通道）、氟标记位置（¹⁹F-通道）以及膜磷脂分布（³¹P¹²C-通道）的精细图谱。更为关键的是，nanoSIMS图像与扫描电镜（SEM）图像经过形态配准后可以精准叠加，将超微结构信息与分子定位信息无缝融合，最终形成兼具结构分辨率与分子特异性的“彩色电镜”图像。这一设计从根本上绕开了传统CLEM（相关光电镜）技术中荧光淬灭、样品形变和配准误差的痛点，因为所有信息都来自同一张切片的同一次检测。
图1 基因编码氟沉积作为超微结构定位分子标记的示意图
02 性能验证
氟沉积的空间分辨率与标记特异性
为了系统评估该技术的成像性能，研究团队以HEK293T细胞为模型，通过Lyn标签将APEX2定位于细胞膜内侧。结果显示，SEM图像中沉积带的厚度为181.2 ± 29.0 nm，而nanoSIMS检测到的氟沉积带厚度为127.1 ± 30.9 nm，表明氟信号能够在百纳米尺度上实现空间定位。进一步比较发现，反映蛋白质分布的¹²C¹⁴N-信号过渡宽度为114.4 ± 16.3 nm，略宽于SEM灰度边缘的过渡宽度（55.6 ± 4.1 nm）。此外，¹²C¹⁴N-与¹⁹F-信号的峰位置偏差仅为5.5 ± 11.2 nm，说明氟沉积信号与蛋白质分布具有较高的空间一致性。由于分子标记信息与超微结构信息能够通过nanoSIMS与SEM成像进行关联，该技术有望减少传统多模态成像中因图像配准带来的误差，为细胞超微结构与分子定位的整合分析提供新的技术路径。
图2 利用nanoSIMS对超微结构分子标记进行定位成像
在确认基本成像性能后，研究团队进一步将该技术应用于线粒体的特异性标记。研究者构建了带有N端线粒体靶向序列（MTS）的APEX2表达载体，利用来源于COX4的线粒体定位信号引导APEX2富集于线粒体基质。双光子多层结构照明显微镜（MSIM）观察结果显示，MTS-APEX2在转染细胞中呈现出典型的丝状线粒体分布，验证了其线粒体靶向定位效果。经BPAF孵育、固定及超薄切片制备后，nanoSIMS成像在线粒体区域检测到明显的¹⁹F-信号富集，其空间分布与线粒体超微结构相吻合。同时，¹²C¹⁴N-信号反映了蛋白质的整体分布，³¹P¹²C-信号则指示膜磷脂的空间分布，二者与电镜观察到的线粒体膜结构相对应。进一步结合元素成像与扫描电镜信息，研究者发现，氟标记能够在保留线粒体嵴和外膜等精细超微结构的同时，实现对目标区域的分子定位，未观察到明显的结构损伤。这可能与BPAF的小分子特性有关。与传统APEX2-DAB标记形成电子致密聚合沉淀不同，该策略通过引入氟元素实现分子定位，避免了大块聚合物对超微结构观察的潜在干扰，为兼顾分子标记与细胞器精细结构保存提供了新的技术方案。
图3 利用APEX2催化的氟沉积实现线粒体标记
为了严格验证氟沉积的靶向特异性，研究团队开展了系统的对照实验。在APEX2同时靶向线粒体膜的细胞中，研究者并行供给DAB和BPAF两种底物。电镜图像显示，APEX2催化的DAB沉积在线粒体区域产生了高电子密度的深色区域，而对应的nanoSIMS图像中¹⁹F信号也在完全相同的位置出现富集。将¹²C¹⁴N-、¹⁹F-和³¹P¹²C-离子分布分别与SEM图像合并后，可以直观地看到氟标记与DAB电镜致密沉淀在空间上完全重合，证明BPAF确实是在APEX2原位催化下发生沉积，而非非特异性吸附。这一结果在两个独立的共转染样本中重复验证，确保了结论的可靠性。
图4 APEX2催化氟沉积的标记特异性
03 应用拓展
从线粒体到多种亚细胞结构
在此基础上，研究团队进一步将标记范围扩展到更多细胞器。通过融合核定位信号，APEX2被成功导向细胞核；通过融合内质网定位序列，APEX2特异性富集在内质网膜上；通过将APEX2融合到α-微管蛋白的N端，研究者甚至实现了对细胞骨架微管网络的标记。nanoSIMS成像结果显示，三种靶向策略都获得了与预期细胞器形态高度一致的¹⁹F-信号分布。标记特异性定量分析表明在线粒体、细胞核、内质网和微管蛋白四种靶向条件下，目标区域的氟沉积强度均显著高于非目标区域。
图5 利用氟沉积标记多种亚细胞结构
04 总结与展望
迈向多靶标分子电镜
基因编码氟沉积策略结合APEX2的分子靶向能力与nanoSIMS的高灵敏度元素成像优势，利用氟元素在生物体系中天然背景低的特点，实现了分子定位与细胞超微结构的关联分析。相较于传统电镜标记方法，该技术有望减少标记沉淀对精细结构的干扰，并为多靶标成像提供新的思路。尽管目前其空间分辨率仍受nanoSIMS成像能力限制，但未来通过优化成像系统、拓展标记体系，有望进一步实现多种分子的同步定位，为解析蛋白质复合物、细胞器相互作用及细胞内分子组织提供新的研究工具。
和元生物有幸为本研究提供相关质粒和AAV病毒，以实际行动助力基础研究！论文作者特别致谢和元生物在本研究中提供的分子生物学支持。
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和元生物
和元生物成立于2013年，作为深耕细胞和基因治疗核心领域的高新技术企业，专注于为细胞和基因治疗的基础研究提供基因治疗载体研制、基因功能研究、药物靶点及药效研究等CRO服务，可提供①组学服务：常规转录组、单细胞转录组、基因组、代谢组及蛋白组等。②载体构建和病毒包装：质粒、siRNA、腺相关病毒（AAV）、腺病毒（ADV）、慢病毒（LVV）、逆转录病毒（RV）、单纯疱疹病毒（HSV）等病毒载体生产服务，提供R&D、实验室级别、GMP级别满足研发、小动物、大动物NHP到临床的不同研究阶段的使用需求。③细胞实验服务：过表达、干扰稳定株构建，单克隆细胞株构建服务及细胞功能学、药效学实验服务。④动物实验及机制研究：神经、代谢、肿瘤动物模型、药效药代、病理切片及蛋白、核酸检测服务。⑤特色项目服务：CRISPR文库筛选服务，外泌体整体研究服务，AAV衣壳筛选服务、听力研究整体项目服务，满足客户定制化或一站式项目服务，助力基础科学研究，促进基础研究到临床转化应用，推动细胞和基因治疗行业发展。