Molecular Cancer | 香港中文大学研究团队解析幽门螺杆菌通过CAFs介导胃癌免疫抑制的双轴机制

整合空间转录组学与单细胞RNA测序技术，系统解析了幽门螺杆菌（H. pylori）感染对胃癌肿瘤微环境中癌症相关成纤维细胞（CAFs）的空间分布、功能状态及其免疫调控作用的影响。

研究明确了CAFs的四种功能亚型，并发现H. pylori感染可显著上调CAFs中THBS1与ZFP36的表达。机制上，THBS1+ CAFs通过WNT5–FZD信号轴促进调节性T细胞（Treg）的招募与局部免疫抑制；而ZFP36则通过结合FN1基因的3′UTR并促进其mRNA降解，抑制CAFs介导的细胞毒性T细胞活化。这两条通路共同塑造了H. pylori阳性胃癌的“免疫冷”微环境，为靶向CAFs的免疫治疗策略提供了新的分子依据。

为了构建胃癌肿瘤微环境（GC TME）的空间分辨图谱，整合了人胃癌组织的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组数据。全面分析了TME内的细胞异质性、空间定位、细胞间通讯和谱系动态，涉及的分析包括：邻域富集分析、配体-受体推断、拟时序分析、空间反卷积和功能注释（图 1A）。

研究发现，幽门螺杆菌感染通过转录重编程癌相关成纤维细胞（CAFs）重塑了胃癌的肿瘤免疫微环境。THBS1⁺ CAF亚群聚集在调节性T细胞（Tregs）附近，可能通过WNT5-FZDs信号通路募集Tregs。同时，RNA结合蛋白ZFP36结合于FN1 3′UTR中富含AU（AUUUA）的元件，促进FN1 mRNA降解，并抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活化。因此，维持 Treg 的 THBS1-WNT5 轴和限制 CTL 活化的 ZFP36-FN1 轴可能共同作用以驱动幽门螺杆菌阳性胃癌中的局部免疫抑制（图 1B）。

图1幽门螺杆菌相关胃癌中 CAF 介导的局部免疫抑制

对空间转录组数据进行细胞类型注释，鉴定出免疫细胞、基质细胞和恶性细胞群，如T细胞、B细胞、树突状细胞、髓系细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和恶性上皮细胞（图 2 A-B）。根据Lauren分类，不同胃癌亚型在细胞组成和空间分布上存在明显的差异。在肠型胃癌中，癌细胞形成致密的上皮细胞簇，而癌相关成纤维细胞（CAFs）和免疫细胞则富集于肿瘤边缘，从而形成清晰的肿瘤-基质边界。相比之下，弥漫型胃癌中癌细胞、CAFs和免疫浸润细胞呈混合分布，导致肿瘤结构紊乱。与弥漫型胃癌相比，肠型胃癌中免疫细胞的比例更高（图 2 C-D）。综上所述，不同亚型的胃癌在空间组织上存在显著差异。

图2 空间转录组揭示了胃癌的细胞组成和亚型特异性

为了研究CAFs的空间异质性，对四种CAF亚型，如proCAFs、iCAFs、matCAFs和myCAFs，进行了空间定位（图 3 A-B）。每种亚型均呈现出独特的分布，反映了肿瘤微环境内的功能区隔化。邻域富集分析进一步揭示了亚型与癌细胞的特异性空间关联。其中，iCAFs与癌细胞的距离最近（图 3 C）。空间聚集指数（SAI）也证实了这一趋势，iCAFs与癌细胞的空间邻近性最强，其次是myCAFs和matCAFs，而proCAFs的空间关联性最弱（图 3 D-E）。

空间原位映射揭示了亚型特异性的聚集模式：肠型肿瘤形成致密的上皮细胞簇，而弥漫型肿瘤则呈现分散分布。这些模式与不同的基质结构和CAF-肿瘤空间关联相对应（图 3F）。标记基因分析进一步证实了肠型和弥漫型胃癌之间的分子差异（图 3G）。与此一致的是，SAI评分表明肠型肿瘤的肿瘤细胞聚集程度显著高于弥漫型肿瘤（图 3H）。综上所述，这些分析表明肠型和弥漫型胃癌存在显著差异，支持亚型特异性的CAF-肿瘤相互作用。

图3 CAF 亚型的空间特征及其与癌细胞的空间关联

为了更深入地探索空间相关的基因表达，整合了来自中国、美国和新加坡的58个胃癌样本的单细胞RNA测序数据集。使用经典标记基因进行细胞类型注释，鉴定到了癌细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、髓系细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞（图 4 A-B）。其中，成纤维细胞可以细分为四种CAF亚型：proCAFs、iCAFs、matCAFs和myCAFs（图 4 C-E）。拟时序轨迹分析表明，proCAFs处于早期发育阶段，随之分化为三个不同的分支，分别是iCAFs、matCAFs和myCAFs（图 4F）。基因差异分析进一步强调了CAF亚型之间的转录组差异，揭示了它们的分子独特性和功能异质性（图 4G）。

此外，推断的空间分布与直接空间聚类得到的结果高度吻合（图4 H-I）。在对CAF亚型募集到癌细胞的单细胞反卷积分析中，iCAFs与癌细胞的空间聚集性最强，而proCAFs的关联性最弱，即iCAFs位于癌细胞附近（图 4 J）。这些发现表明，CAF亚型不仅在空间定位上存在差异，而且在发育状态和转录调控方面也存在差异，突显了TME内转录和空间异质性的协同作用。

图4 单细胞转录组分析揭示CAF 亚型及其空间动态

一个核心问题是幽门螺杆菌感染是否会改变胃癌表达谱，这些改变是如何影响CAF细胞组成及基因调控。为了解决这些问题，分析了幽门螺杆菌阳性和阴性胃癌的空间转录组数据。空间映射显示，感染肿瘤中CAF的丰度显著增加（图 5A ）。此外，THBS1和ZFP36是幽门螺杆菌阳性样本中最显著上调的基因（图 5B -E）。在ACRG队列中也验证了这些发现（图 5 F）。

拟时序分析表明，THBS1 和 ZFP36在成纤维细胞终末阶段逐渐升高，同时凋亡相关基因 FAS 和 PTK2 也被诱导表达（图 5G）。在 TCGA 和 ACRG 数据集中，THBS1 和 ZFP36存在显著的正相关性（图 5H）。THBS1或 ZFP36高表达均预示着更短的生存期（图 5I）。综上所述，这些结果表明，幽门螺杆菌感染驱动 CAF 扩增，并诱导 THBS1 和 ZFP36 的转录激活。

图5 THBS1 和 ZFP36 在幽门螺杆菌相关胃癌中的表达及其预后意义

为了研究THBS1⁺CAFs在幽门螺杆菌阳性胃癌中的潜在免疫调节作用，根据THBS1表达分为THBS1⁺和THBS1⁻CAFs的细胞簇（图 6 A-B）。值得注意的是，THBS1⁺CAFs富集了调节性T细胞（Treg）相关的信号通路，包括FOXP3/TGF-β信号通路和CD4⁺ T细胞活化通路（图 6 C）。接下来，对T细胞群进行了表征，鉴定出六个亚群，如细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、Treg、Th1、Th2、Th17和增殖性T细胞（图 6 D-E）。SAI分析揭示了Treg细胞与THBS1⁺CAFs之间存在显著的空间关联（图 6F）。THBS1⁺CAFs附近Treg细胞富集程度高的肿瘤与患者总生存期缩短相关（图 6G）。

此外，公共数据集（GSE25087和GSE7460）分析表明：Treg基因的空间分布与THBS1⁺ CAF的定位部分重叠（图 6I）。细胞间通讯分析表明，THBS1⁺ CAFs与Treg细胞之间存在相互作用，其中WNT5A-FZD6和WNT5B-FZD5是最显著的作用轴（图 6J-L）。这些结果表明，THBS1⁺ CAFs 在空间上与 Tregs 相关，并参与 WNT5-FZDs 信号传导，从而有助于在幽门螺杆菌相关胃癌中建立局部免疫抑制。

图6 THBS1+CAFs促进幽门螺杆菌相关胃癌中的Treg募集和免疫抑制

除了Treg 募集相关的通路外，研究了其他 CAF 亚群是否参与不同的免疫调节分子机理。为此检测了 CAF 相关转录本的上游调控因子，并重点关注 ZFP36，这是一种 RNA 结合蛋白，已知其可通过 3'UTR 中的富含 AU 的元件（尤其是 AUUUA 基序）介导 mRNA 降解（图 7A）。

对 CAF 进行相关性分析，鉴定出 735 个候选基因，这些基因均与 ZFP36 表达呈负相关，且包含 ≥ 5 个 ATTTA 基序（图 7B）。这些靶基因主要参与免疫相关通路（图 7C）。空间特征图显示了 ZFP36 与部分免疫调节基因（包括 FN1、FAP、INHBA、COL10A1 和 STC1）的表达模式（图 7D）。其中，FN1 与 ZFP36 的负相关性最强（图 7E）。来自四个独立样本的 LACE-seq 数据进一步证实了 ZFP36 与 FN1 3'UTR 的结合（图 7F）。为了进一步探究 ZFP36+CAFs的转录调控，应用SCENIC推断单细胞水平的转录因子活性，ZFP36 相关靶点的通路富集分析突显了其在 T 细胞活化和共刺激信号传导中的作用（图 7G）。

为了评估这种调控的免疫学作用，分析了 FN1与不同免疫细胞之间的相关性。 CAFs中FN1的表达与多种T细胞亚群呈正相关，尤其是活化的CD8+T细胞和γδ T细胞（图 7H ）。细胞通讯分析表明，FN1+ CAFs与T细胞的相互作用更为广泛，主要通过整合素和免疫检查点相关基因的调控实现，如α5β1-FN1、CD86-CTLA4和TNFSF4-TNFRSF4（图 7I）。空间细胞间网络进一步证实，FN1+CAFs与细胞毒性T细胞亚群（包括CTL）的空间相互作用更强（图 7J）。这些结果表明，ZFP36则通过结合FN1基因的3′UTR并促进其mRNA降解，抑制CAFs介导的细胞毒性T细胞活化。

图7 ZFP36通过转录后抑制作用抑制幽门螺杆菌相关胃癌中FN1 + CAF介导的T细胞活化