重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-associated Virus, rAAV)是一种对人体无致病性的单链DNA病毒，具有免疫原性低，转导效率高，且不能自我复制的特点，可实现体内和体外高效基因递送。目前，多款基于rAAV的基因治疗产品已经获批上市，并取得了良好的疗效，rAAV也成为基因治疗行业最为炙手可热的明星产品。 

那么，能够高效、安全递送基因的rAAV是如何被生产出来呢？当下主流的生产系统有两种，一是利用经典的三质粒包装系统，瞬时转染人293细胞产生病毒；另一种即利用携带rAAV载体基因组、Rep蛋白和Cap蛋白的杆状病毒感染Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫细胞，从而产生rAAV病毒。这两种生产系统有何差异？实验和临床应用时，哪种效果更好？

 

基于293细胞的rAAV包装系统

三质粒转染人293细胞是实验室及制药工业领域最常用的rAAV生产方法之一，该系统最经典的生产工艺主要是同时利用穿梭质粒（含有目的基因表达框）、包装质粒（含AAV复制功能的Rep蛋白与衣壳蛋白Cap表达框）与辅助质粒（含有腺病毒的重要元件，参与病毒颗粒增殖）同时转染293细胞，从而获得rAAV病毒颗粒。美国FDA批准的Zolgensma、Luxturna两款rAAV基因治疗产品，均是利用了三质粒转染人293细胞的生产体系。 

图1 三质粒转染293细胞生产rAAV

图片来源：Mueller C et al., Curr Protoc Microbiol. 2012

 

Sf9包装系统

Baculovirus/Sf9是一种替代哺乳动物细胞系的rAAV生产方案，该系统利用杆状病毒表达载体（Baculovirus expression vectors, BEVs）感染Sf9昆虫细胞来生产rAAV病毒颗粒。借助Sf9细胞可以大量表达重组蛋白的特点，该系统使用含有rAAV基因组以及AAV-Rep、AAV-Cap基因的昆虫杆状病毒转导Sf9细胞，使rAAV在Sf9细胞中组装，最终达到大规模生产rAAV的目的。

 

由于Sf9昆虫细胞可以在大规模反应器中高密度悬浮培养，因此该系统更容易放大规模；同时，杆状病毒对于哺乳动物和植物是非致病性的，且采用无血清培养体系，相较依赖质粒转染的293细胞生产系统更为安全。2012年，欧洲药品管理局（EMA）批准的第一个rAAV基因治疗药物Glybera正是利用Sf9昆虫细胞生产系统生产的rAAV病毒颗粒。

 

293细胞包装系统与Sf9包装系统的差异

尽管在过去的10年里，监管部门陆续批准若干基于AAV的基因治疗产品，但该领域仍面临多项挑战，例如rAAV的产量、质量、免疫原性等。2020年9月，Neil G. Rumachik等人在Mol Ther Methods Clin Dev.发表的工作就对293细胞与Sf9细胞的rAAV生产系统差异做了分析。该工作发现，差异主要集中在生产过程中产生的杂质、衣壳蛋白翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)和体内/体外的感染效率（图2）

图2 Sf9细胞包装系统与293细胞包装系统生产的rAAV差异

图片来源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

 

文中明确指出：

1）不同的包装系统生产的rAAV病毒颗粒衣壳具有不同的PTMs，包括糖基化、乙酰化、磷酸化和甲基化（图3）；

2）两个包装系统包装过程中，rAAV基因组均发生甲基化，但两套系统似乎对基因组产生了相反的作用，Sf9细胞生产体系产出的rAAV趋向抑制基因表达，293细胞生产的rAAV出现趋向激活基因表达；

图3 293细胞和sf9细胞平台生产的rAAV衣壳修饰差异

图片来源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

 

3）不同系统生产的rAAV的空壳率及杂质也有所差异，293细胞生产的rAAV病毒空壳率显著更低（图3），产生的杂质与包装过程产生的核酸和蛋白质相关；而Sf9细胞系统空壳率相对较高，杂质与内肽酶活性和蛋白质水解有关，此外，杆状病毒系统产生的杂质要么是结构性的，要么是与病毒逃逸有关。

4）另外，293细胞生产的rAAV显现出更强的体内及体外感染能力，研究发现无论是在体内还是体外实验，无论是通过肌肉注射还是通过尾静脉系统给药注射，293细胞生产的rAAV都具有更好的感染能力（图4）。

 

图4 不同生产体系生产的rAAV在体外及骨骼肌中的感染能力差异

图片来源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

 

因此，从这些数据展示可以看到，基于293细胞生产的rAAV可能比Sf9有更好的感染效率、更高的质量，也更有临床应用的潜力。当然，不可否认的是，Sf9系统rAAV包装体系具有更高的rAAV包装产率，假以时日，解决上述问题的Sf9包装系统亦有潜力成为基因治疗载体生产的重要力量。

 

和元生物拥有授权清晰的HEK293细胞系，可对基于该细胞的rAAV生产系统开展优化及改造，开发更好的rAAV生产体系。同时，和元生物使用自有的GMP级病毒包装质粒用于研究级rAAV病毒载体的生产，不计成本，全力减少批次间差异、杂质及污染，让基因递送触手可及！

 

别人只追求滴度时，我们还追求更有效；

别人只追求纯度时，我们还追求更安全；

别人只追求承诺时，我们还追求更真实；

别人只追求周期时，我们还追求更稳定。

在看不见的地方努力，只为给您提供稳定的高品质产品！

和元生物用心做科研，让基因递送触手可及

 

参考文献

[1] Rumachik NG, Malaker SA, Poweleit N, Maynard LH, Adams CM, Leib RD, Cirolia G, Thomas D, Stamnes S, Holt K, Sinn P, May AP, Paulk NK. Methods Matter: Standard Production Platforms for Recombinant AAV Produce Chemically and Functionally Distinct Vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 May 22;18:98-118. doi: 10.1016/j.omtm.2020.05.018. PMID: 32995354; PMCID: PMC7488757.[2] Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019 May;18(5):358-378. doi: 10.1038/s41573-019-0012-9. PMID: 30710128; PMCID: PMC6927556.[3] Bulcha JT, Wang Y, Ma H, Tai PWL, Gao G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 2021 Feb 8;6(1):53. doi: 10.1038/s41392-021-00487-6. PMID: 33558455; PMCID: PMC7868676.[4] Mueller C, Ratner D, Zhong L, Esteves-Sena M, Gao G. Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Microbiol. 2012 Aug;Chapter 14:Unit14D.1. doi: 10.1002/9780471729259.mc14d01s26. PMID: 22875565; PMCID: PMC4358842.