慢病毒是一类改造自人免疫缺陷病毒的病毒载体，基因组是RNA，可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，借助慢病毒载体可以进行编码基因和非编码基因的过表达、干扰、敲除和内源性激活等操作，满足不同的基因操作需求。慢病毒的宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点，使其能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，此外，借助慢病毒载体改造T 细胞用于CAR-T细胞治疗。 

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸，不具有蛋白编码能力的线性RNA分子，基因组DNA转录生成lncRNA后，一些lncRNA在细胞核内发挥功能，另外一些lncRNA被转运到细胞质，在细胞质中lncRNA可以调控mRNA稳定性、翻译效率和干扰蛋白翻译后修饰。
 

LncRNA分类

LncRNA根据其相对位置在调控靶编码基因中发挥重要作用，根据其在基因组上与编码基因相对位置的不同，可以将lncRNA分为以下几类（见图1）：1.启动子区（来自启动子区域的转录本）；2.内含子间（主要产生于编码基因的内含子区）；3.双向（与蛋白质编码基因共享相同的启动子，但转录方向相反）；4.正义链（转录方向与蛋白质编码基因方向相同，存在于同一编码基因正义链，具有重叠的外显子）；5.反义链（转录方向与蛋白质编码基因方向相反，存在于反义链，至少有一个外显子重叠）；6.3’UTR区（来自3’UTR区域的转录本）；7.基因间（来自于两个蛋白质编码基因之间的DNA序列）。与mRNA类似，lncRNA也可以存在于细胞核或细胞质中，但主要位于细胞核。

 

图1 长链非编码RNA分类

来源：Xiaomei Huang et al., Canner Lett. 2018

 

LncRNA对基因表达的调控

由于lncRNA的复杂性和多样性，不能简单地根据其结构或序列来描述其功能，但lncRNA的一个重要作用是调节邻近蛋白编码基因的表达。LncRNA在不同水平上调节基因表达：

 

表观遗传修饰

表观遗传修饰是指在细胞核DNA序列不发生变化的情况下，基因表达发生可逆和可遗传的变化，这种修饰包括染色质重塑、DNA甲基化和组蛋白修饰。

1.组蛋白乙酰化：组蛋白乙酰化的过程促进了基因表达、蛋白质活性或生理过程。

2.染色质修饰复合物的招募：lncRNA将染色质修饰复合物招募到特定的位点，介导相关基因的表达或沉默。

3.DNA甲基化：通过改变染色质结构、DNA构象、DNA稳定性以及DNA与蛋白质的相互作用来控制基因的表达。

 

转录调控

4.转录调节：LncRNA可抑制靶基因转录因子活性，抑制其基因表达。如lncRNA的转录干扰临近基因的表达；lncRNA通过封阻启动子区域干扰基因表达；lncRNA与RNA结合蛋白作用，定位到基因启动子区调控基因表达；lncRNA能调节转录因子活性，调控基因表达。

 

转录后调控

5.可变剪接：LncRNA可以促进pre-mRNA和可变剪接因子的结合，有助于产生成熟mRNA。

6.竞争性RNA：LncRNA可以作为miR海绵，竞争miRNA，然后解除对靶基因的抑制。

7.蛋白去磷酸化：LncRNA参与蛋白去磷酸化。

8.抑制蛋白降解：LncRNA与蛋白质相互作用并抑制其泛素化降解。
 

 

 

图2 LncRNA在不同水平上调节基因表达

来源：Xiaomei Huang et al., Canner Lett. 2018

 

LncRNA虽然不能编码蛋白质，但可以向下游传递信息，调控基因表达，表明lncRNA可能作为基于RNA的信息库，具有与蛋白质组学竞争的能力，在疾病诊断和靶向治疗中甚至比蛋白质更加敏感和特异。因此lncRNA的研究越来越广泛。

 

慢病毒包装系统缺陷

但是，目前lncRNA慢病毒包装系统普遍存在一些问题：

1.慢病毒是RNA病毒，lncRNA的转录终止需要polyA，而polyA会导致慢病毒包装过程中，慢病毒基因组的表达提前终止，导致慢病毒包装不成功；

2.常规慢病毒载体表达lncRNA，由于不能及时终止，会带有WPRE等无关序列，从而影响lncRNA的高级结构, 而高级结构是lncRNA发挥功能的决定性因素, 这些多余的序列势必对lncRNA的功能造成不可预料的影响；

3.有些lncRNA会发生自切割，包装时，慢病毒基因组也可能因为lncRNA的自切割而发生断裂，导致出毒失败。

 

针对以上这些问题，和元生物推出新升级慢病毒系统一次性解决以上问题，让lncRNA精确表达。

 

新升级慢病毒系统优势

1.LncRNA精准表达。

2.载体上荧光表达更亮。

3.改善由于基因引起的不出毒，出毒更稳定。

 

验证结果：

PCR验证表达精确：  
 

 

感染效果图：

 

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参考文献

[1] Xiaomei Huang,Xi Zhou., et al. Advances in esophageal cancer: A new perspective on pathogenesis associated with long non-coding RNAs.Cancer Lett.2018 Jan 28;413:94-101.doi: 10.1016/j.canlet.2017.10.046.