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外泌体研究整体解决方案

人阅读 发布时间:2020-03-04 11:56

外泌体概况

一、什么是外泌体?
外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一种,大小在 30-150nm,由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外,广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中,包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。

二、为什么研究外泌体?
外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递,调控细胞生理活动。同时,外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用;此外,外泌体还可以作为「天然的纳米粒子」来进行药物递送。

三、外泌体相关数据库有哪些?
  • exoRBase 数据库收集和描述人类血液外泌体中所有长的 RNA,包括 circRNA、lncRNA 和 mRNA。
  • EVpedia 和 Vesiclepedia 数据库汇总了不同囊泡研究中发现的蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息。
  • ExoCarta 数据库主要收录了包括人、大鼠、小鼠、绵羊等几个物种的 286 个研究结果,涉及蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息。

四、样本来源的外泌体分离
1、样本收集与预处理:
外泌体存在于人类或动物的各种体液中,我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体,分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体,必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。



 



不同的实验样本采集时需要注意的地方不一样,如细胞培养上清在收集样本前需换成无外泌体血清培养、血浆样本采集时用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集时需要加抑菌剂等。
2、外泌体分离与保存:
从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来,主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是我们后续开展外泌体研究的关键步骤,目前分离外泌体的方法主要包括以下几种,如差速超速离心(简称超离)、密度梯度离心、体积排阻层析、超滤、免疫磁珠法、试剂盒分离。
分离外泌体的方法各有优缺点,但从 Science、Nature 和 Cell 杂志上发表的文章来看,超离技术仍然是最常见技术之一。下面是超离技术的基本步骤,不过不同样本的分离方法有区别。

 
和元上海提示,提取的外泌体在短时间(一周之内)使用,可以放在 4 度保存,如果长时间保存可以放在-20 度或-80 度保存。也可以将外泌体进行分装,分别放在-20 度或-80 度。

五、外泌体鉴定和检测
外泌体分离之后,需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物,多角度进行鉴定。
1、透射电镜鉴定法:简称 TEM,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。
图片来源于和元上海
 
2、纳米颗粒跟踪分析法:简称 NTA,该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快,检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。
图片来源于和元上海
 
3、Western blot 分子标志物检测:外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族,如 CD9、CD63 和 CD81;细胞质蛋白,如肌动蛋白(Actin)和钙磷脂结合蛋白(Annexins);参与生物功能的分子,如凋亡转接基因 2 互作蛋白 X(ALIX)、肿瘤易感基因 101 蛋白(TSG101)、热休克蛋白(HSP70、HSP90),以及细胞分泌的特异性蛋白。
 
六、外泌体分子检测
外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸,可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA 等进入受体细胞,参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和 RNA 不太相同,可作为多种疾病的早期诊断标记物,也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。
1)miRNA高通量分析
2)mRNA高通量分析
3)lncRNA高通量分析
4)circRNA高通量分析
5)蛋白质组分析

七、外泌体的功能研究
对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪,有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前常用亲脂性染料对外泌体进行标记,亲脂性染料主要包括两类,一是 PKH67(绿色)和 PKH26,二是 DiI(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、DiR(深红色荧光)。

 
(yawen Li etal., Int J Nanomedicine. 2018; Teng Ma et al., Stem Cells Int. 2018)

此外,可以将外泌体直接加入受体细胞培养基中,与受体细胞进行共培养,观察细胞的功能变化,或者将外泌体注射入动物模型中,观察动物表型变化和检测动物相关指标,如肿瘤转移、血糖水平、胰岛素敏感性等。
 
(Tian Fang et al., Nat Commun. 2018)

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