图2. 光遗传学的基本原理（以ChR2和NpHR为例）
 

光遗传学技术的研究步骤

光遗传学技术的应用主要包括以下几个关键步骤（图3）：

1、需要寻找合适的光敏蛋白：例如起兴奋神经元作用的Channelrhodopsin-2（ChR2），起抑制神 经元作用的Halorhodopsin（NpHR）和Archaerhodopsin（Arch）等，这类蛋白质具有天然的光敏性，或经过修饰后具有光敏性；

2、将遗传信息传递给靶细胞：一般通过病毒转导、转染、转基因动物等方式将光敏蛋白的遗传信 息传递给靶细胞；

3、可控性演示：即通过导入光纤、控制激光来实现对神经元活动的精确控制；

4、实验方法的有效性验证：一般采用电极记录神经元细胞膜内外电压变化，以此验证光敏感蛋白 的有效性；

5、表型检测：通过行为学测试来评估神经元活动对动物行为的影响。

图3. 光遗传学实验基本步骤（以ChR2为例）
 

几种激活神经元的通道蛋白

1、ChR2(H134R)：ChR2的突变体，将第134个氨基酸由组胺酸突变为精胺酸，该蛋白质可以产生两 倍的光电流，但通道开关速度也比野生的ChR2慢了一倍；

2、ChR2(C128S/D156A): ChR2的突变体，超灵敏光敏感通道，用蓝色激光打开通道，然后用绿色或 黄色激光关闭通道，可以打开其离子通道长达30分钟；

3、ChR2(E123T/T159C): ChR2的突变体，更大的光电流和更快的动力学变化；

4、ChETA：ChR2的突变体，使得神经元在激光刺激下可以发放200Hz的spike，而其他的ChR2 通道 蛋白只能达到40Hz；

5、C1V1：由ChR1及由团藻发现的VChR1组合在一起的通道蛋白，在红色激光刺激下打开通道。
 

几种抑制神经元活动的通道蛋白

1、NpHR：即为Halorhodopsin，第一个有效抑制神经元活动的光遗传学工具，在黄绿激光照射下会 将氯离子打进神经元内，而抑制神经元活动。当把NpHR表达在哺乳动物脑内时，会聚集在内质网上，而如果将内质网输出元件加在 NpHR基因序列后面，这样可以使得NpHR在胞内高量表达，而且不会聚集在内质网上，这样修改过的NpHR被称为eNpHR2.0。但是 eNpHR2.0在细胞膜的聚集仍然不够，而将一个高尔基体输出元件和来自于钾离子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列后面 ，这样就能实现在神经元细胞膜上的高量聚集，这样修改过的NpHR被称为eNpHR3.0；

2、Arch：即为Archaerhodopsin，是一种黄色激光激活的外向整流质子泵，能够将带正电的质子从 神经元内移动到细胞外环境中，使神经元处于超极化状态，从而保证神经元处于静息状态。在特定条件下，可用于增加细胞内pH或 减少细胞外基质pH。和NpHR相比，当激光关闭的时候，Arch立即从通道打开状态恢复到关闭状态。

3、Mac:即为 Leptosphaeria maculans fungal opsins，蓝色激光激活的质子泵，能够将带正电的 质子从神经元内移动到细胞外环境中，使神经元保持超极化状态，从而保证神经元处于静息状态。
 

化学遗传学技术介绍

化学遗传学是指：对一些生物大分子实行改造，使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用的过 程。化学遗传学和分子遗传学一样，均是遗传学的一个分支，由于其可控的、可逆的（可以随时加入或除去化合物，从而启动或中 断特定的反应）特性，已经在信号转导、药物开发、功能基因组学等方面的研究中得到了广泛的应用。

目前已改造的生物大分子包括核酸杂交、蛋白质激酶、各种代谢酶和G蛋白耦联受体（G protein– coupled receptors，GPCRs）。

现在有很多基于GPCRs改造的化学遗传学平台，例如基因编码受体的等位基因特异激活（allele-specific activation of genetically encoded receptors）、只能被合成配体激活的受体（receptors activated solely by synthetic ligands, RASSLs ）、基因工程改造的受体（engineered receptors）和只由特定药物激活的受体（designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs）。其中，DREADDs已成为应用最广泛的化学遗传学技术，本文也将主要讨论DREADDs技术。
 

DREADDs

现在有很多由叠氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide，CNO）激活的DREADDs，他们会选择性地作用 于不同的GPCR级联反应，包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin，其中应用最广泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。

1.Gq-DREADD和hM3Dq

最初的Gq-DREADD即hM3Dq，改造自人毒蕈碱型乙酰胆碱受体（the human muscarinic acetylcholine receptor，mAchRs）亚型M3（也称为hM3）。在正常生理状况下，hM3和乙酰胆碱结合，然后和Gq类G蛋白耦合受体耦 合，作用于磷脂酶C、肌醇三磷酸和胞内钙离子这一信号通路（图1）。

令人吃惊地是，只要将Y3.33C和A5.46这两个位点突变，就能使hM3受体不能和乙酰胆碱耦合，但是 会和纳摩尔浓度级别的CNO结合，这种突变后的hM3受体被命名为hM3Dq (human M3 muscarinic DREADD receptor coupled to Gq)。 由于Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型中是保守的，M1和M5也已经被成功改造为Gq-DREADD（hM1Dq和hM5Dq）。但 是到目前为止，hM3Dq仍然是应用最多的Gq-DREADD。在不同的细胞类型中，CNO诱导hM3Dq的结果是不一样的，比如：

1) 在成熟神经元中，CNO诱导hM3Dq的结果是将神经元去极化（depolarization），加强神经元的 兴奋性，这也是hM3Dq最常用的功能，即促使神经元的放电活动；

2)在星形胶质细胞中，有人报道CNO诱导hM3Dq的结果是增加星形胶质细胞Ca2+的释放，从而改变自 主神经系统的生理条件；

3)在神经系统以外，也有一些研究，例如在胰腺Β细胞表达hM3Dq，急性CNO处理会促进胰岛素的释 放，而慢性CNO处理导致Β细胞数目增加；在肝细胞中，激活hM3Dq会增加血糖水平，也许是因为糖原分解和糖异生作用增加。

DREADDs技术的研究步骤

DREADDs技术的应用主要包括以下几个关键步骤（图3）：

1.确定合适的DREADDs受体：一般来说，如果是想激活神经元，则选择hM3Dq，如果是想抑制神经元 的活性，则选择hM4Di；

2.将遗传信息导入到动物体内：一般通过病毒注射或者转基因动物的方式将遗传信息传递给靶细胞 ；

3.可控性演示：即通过控制CNO的给药时间，实现对细胞神经元活动的控制；

4.实验方法的有效性验证：一般采用电极记录神经元细胞膜内外电压变化，以此来验证DREADDs受 体的有效性；

5.表型检测：通过实验确认激活或者抑制神经元活动给实验动物带来的影响。

DREADDs技术的优缺点

作为两种最常见的控制神经元活动的技术，光遗传学和化学遗传学技术之间各有优缺点，下面我们 就以光遗传学为参照对象，谈谈DREADDs技术的优缺点。

1.DREADDs技术的优点主要有：

1）实验要求较低：如果要使用光遗传技术，需要准备很多配件，例如光纤、激光控制器和导管等 等，而DREADDs只需用注射或者喂食CNO即可；

2）操作较简单：也正是因为光遗传需要很多配件而DREADDs不需要，所以在实验操作的过程中， DREADDs相对来说比较简单；

3）较长时间的处理：对于光遗传来说，由于激光产热等机械限制，长时间处理几乎不可能实现， 而持续CNO给药已经证明是可行的。

2.DREADDs技术的缺点主要有以下两点：

1）操作神经元活动的时间精确度不高：光遗传学可以通过控制激光使时间精准度到毫秒级别，而 DREADDs通过CNO连分钟级别的精度程度都很难达到，而且CNO作用在神经元上之后一般需要2小时才能从膜上清除，所以说DREADDs操 作神经元活动的时间精确度不高；

2）刺激的强度无法掌控：虽然研究人员可以增加或者减少CNO的给药量，但是用DREADDs还是不可 能控制给神经元刺激的量，而且也不能随时增强或者减弱刺激，但是光遗传通过控制激光，可以精准地、随时地调节给神经元刺激 的强度，这对于某些刺激强度依赖的神经环路研究有不可替代的优势。
 

神经元钙离子成像

钙成像技术（calcium imaging）是指利用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度的方法。在神经系统研究方面，在活体（in vivo）或者离体（in vitro）研究中，钙成像技术被广泛应用于同时监测成百上千个神经元内钙离子的变化，从而检测神经元的活动情况。有了钙成像技术，原本悄无声息的神经活动就变成了一幅斑斓闪烁的壮观影像，科学家终于可以亲眼看着神经信号在神经网络之中往来穿梭。因此，这种技术一出现，就受到了全世界神经科学家们的追捧，至今依然是人们观测神经活动最为直接的手段。

钙成像技术的基本原理

在生物有机体内，钙离子产生各种各样的胞内信号，这些胞内信号几乎在每种类型的细胞中都存在，在很多功能方面有重要作用，例如心肌细胞收缩的控制和从细胞增殖到细胞死亡整个细胞周期的调节等。

在哺乳动物的神经系统中，钙离子是一类重要的神经元胞内信号分子。在静息状态下，大部分神经元的胞内钙离子浓度为50-100nM，而当神经元活动的时候，胞内钙离子浓度能上升10-100倍，增加的钙离子对于含有神经递质的突触囊泡的胞吐释放过程必不可少。也就是说神经元的活动与其内部的钙离子浓度密切相关，神经元在放电的时候会爆发出一个短暂的钙离子浓度高峰。

神经元钙成像技术的原理就是借助钙离子浓度与神经元活动之间的严格对应关系，利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针（钙离子指示剂，calcium indicator），将神经元中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来，从而达到监测神经元活动的目的。

钙离子指示剂

现在广泛使用的钙离子指示剂有化学性钙离子指示剂（chemical indicators）和基因编码钙离子指示剂（genetically-encoded indicators）两类：

1.化学性钙离子指示剂：指的是可以螯合钙离子的小分子，所有这些小分子都基于EGTA（乙二醇双四乙酸）的同系物BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），BAPTA能够特意地和钙离子螯合，而不会和镁离子螯合，所以被广泛地用作钙离子螯合剂。现在使用较广泛的化学性钙离子指示剂有：Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。

2.基因编码钙离子指示剂：这些指示剂是来自于绿色荧光蛋白（GFP）及其变异体（例如循环排列GFP，YFP，CFP）的荧光蛋白质，与钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶M13域融合。现在使用较广泛的基因编码钙离子指示剂有：GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch，其中GCaMP6由于它有着超强的敏感度，现在被广泛应用于活体钙成像研究。

钙成像技术在神经科学研究中的可能应用

1.记录培养的神经元的活动。

2.记录脑片上神经元的活动。

3.活体记录神经元的活动。由于离体实验本身的限制，现在越来越多的神经科学家倾向于做活体钙成像实验，希望能得到更准确且更能反应生理状况的数据。得益于双光子荧光显微镜的发展，现在，在实验动物处于活体状态下进行钙成像记录的技术取得了飞速进展。

4.活体记录神经元树突和树突棘（spine）的活动。由于对实验精度的要求，有些科学家不仅仅想记录单个神经元的反应，他们还想更精确地知道神经元上哪些树突和树突棘参与了某个行为，也就是说他们需要在活体条件下，对单根树突以及树突上spine进行钙成像记录实验。由于双光子荧光显微镜和GCaMP6基因编码钙离子指示剂的发展，现在，对树突和树突棘用钙成像实验进行记录也成为了可能。

CaMPARI:瞬间即永恒

传统的钙成像技术受限于显微镜的视野，只能对很小的一片区域进行记录。随着神经科学的进步，人们认识到大脑运作需要借助许多不同脑区的相互协作，要对这些过程进行研究，需要对整个大脑的神经活动进行细致的观测，而传统的钙成像技术在这一方面毫无办法。

另外，由于传统钙成像实验要求成像的光路极为稳定，因此科学家需要把实验动物的脑袋固定起来以方便成像实验。脑袋被固定的实验动物，大脑活动与自由状态下势必存在差别，对科研家而言，这样获得的数据可能还是不够准确。正因如此，神经科学迫切需要一种能够兼顾全局和微观的新型钙成像技术，这就是2015年2月份科学家在著名杂志Science上发表的文章所要解决的问题，他们介绍了一种全新的蛋白CaMPARI（calcium-modulated photoactivatable ratiometric integrator）。

CaMPARI蛋白在正常状态下会发出绿色荧光（green），而如果对这种蛋白同时使用高浓度钙离子与紫外光处理，它就会不可逆、永久地转变成另一种能发出红色荧光（red）的构象，即实现将瞬间的神经元活动变成永久的红色荧光蛋白表达（图1）。

研究人员通过转基因技术将这种新型蛋白导入到实验动物的神经系统中，然后用高强度的紫外光照射动物的大脑，通过检查荧光，找到发红色荧光的神经元，这些神经元即是在紫外光照射期间活跃的神经元。由于紫外光可以对着整个大脑进行照射，所以理论上，人们可以对全脑进行检查。

为了验证CaMPARI的效果，Science文章研究团队分别在斑马鱼、果蝇和小鼠这三类主要的模式动物身上进行了测试。例如，由于斑马鱼的头部完全透明，所以斑马鱼经常被用作为钙成像的模式生物。研究团队通过简单的方法改变斑马鱼的状态，然后通过CaMPARI检测不同状态下斑马鱼脑部的神经活动。结果显示CaMPARI可以良好地反应斑马鱼脑部的神经活动，比如在麻醉状态下，斑马鱼神经元的活动因为受到抑制而表现出一片绿色，而当有药物诱导癫痫的状态下，神经元的广泛异常放电导致红色荧光蛋白的表达异常丰富（图2）。

 

Science文章第一作者孙一指出：作为一种快速灵敏的神经活性标记技术，CaMPARI可能在脑功能图谱和连接组学的研究方面有着重要且广泛的应用价值。

其他相关应用

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