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肌营养不良治疗用葡萄糖：你见过吗？
907 人阅读发布时间：2016-11-15 15:10
导读
Duchenne 型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是儿童中最常见的类型，患者由于持续性肌肉退化和萎缩，通常 20 岁左右便会死亡，直到今天，对这一疾病人们仍未有很好的治疗方案。本期解读的就是天津医科大学尹海芳教授研究组发表在《Nature Communications》上的题为《Hexose enhances oligonucleotide delivery and exon skipping in dystrophin-deficient mdx mice》的最新研究论文，研究结果为探寻有效的 DMD 治疗策略提供了新思路。文中的腺相关病毒（AAV）包装由和元生物提供。
前言
肌肉萎缩疾病是困扰人类多年的一类重大疾病，主要表现为肌肉营养不良，难以行动，代谢紊乱，许多病人寿命很短。在多种肌肉萎缩症中，DMD 是最为凶险的一种，骨骼和肌肉发育畸形，随着病情的进展，病变会波及心脏和呼吸系统，最终造成患者心功能紊乱或呼吸衰竭而导致死亡。DMD 的发生原因在于 dystrophin 基因发生了突变使机体缺乏 dystrophin 蛋白，后者是机体用于保持肌肉细胞膜完整性的重要蛋白质。基于 DMD 的发病频率和严重程度，其已成为医学研究的重要课题。目前对这一疾病尚无有效治疗方案，但反义寡核苷酸介导的外显子跳读是目前最有应用前景的治疗方法之一。己糖（hexose）是含有六个碳原子的单糖，是单糖中最重要的糖类，与机体的营养代谢关系最密切，常见的己糖有葡萄糖、甘露糖、果糖和山梨糖等。本期解读的就是天津医科大学尹海芳教授研究组发表在《Nature Communications》上的题为《Hexose enhances oligonucleotide delivery and exon skipping in dystrophin-deficient mdx mice》的最新研究论文，该文集中论述了使用己糖可以增强外显子跳读和寡核苷酸递送，为使用寡核苷酸治疗 DMD 提供了非常有价值的基础研究依据。
研究背景
反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, AO）技术是将短的 DNA 或 RNA 运送至靶组织，通过干扰 RNA 的加工过程从而达到调整基因表达的一种技术。近年来研究人员尝试将反义核苷酸技术应用到 DMD 的治疗上，纠正受到破坏的读码框，恢复正常 dystrophin 蛋白的表达。磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers,PMO）就是一种对 DMD 具有外显子跳跃治疗潜能的 AO.小鼠静脉注射 PMO 后虽可有限增加骨骼肌中的 dystrophin 表达水平，但系统递送效率仍然有限。因此如何提高 AO 递送到肌肉细胞的效率及相应的安全性问题是该技术临床前应用研究的重点，也是解锁核酸疗法潜能、开发可广泛使用的高效递送技术的关键所在。目前临床输液中普遍使用的 5% 葡萄糖已被证明可以改善静脉注射的小干扰 RNA-外泌体、小干扰 RNA-肽复合体的稳定性。而目前尚不明确血糖浓度的升高对 AO 递送治疗 DMD 的影响。
动物模型的选取：
本文选取的 mdx 小鼠是目前研究肌营养不良的经典模型，与 DMD 患者一样，mdx 小鼠骨骼肌细胞膜上不表达 dystrophin 蛋白。mdx 小鼠的组织学在早期是正常的，在 3 周左右出现肌细胞变性坏死，表现出肌无力症状，随着疾病发展， 肌细胞再生占据主导地位，病情趋于平稳，无力症状得到改善。
研究结果
1、PMO 联合碳水化合物促进 dystrophin 缺陷小鼠表达 dystrophin首先 mdx 小鼠胫骨前肌肉联合注射 PMO 和 5% 葡萄糖后，与对照组相比，出现大量 dystrophin 阳性肌纤维，dystrophin 蛋白表达水平显著增加。不仅是 5% 葡萄糖，其他己糖类如 2.5% 葡萄糖和 2.5% 果糖混合物（GF）、5% 果糖、5% 甘露糖分别与 PMO 联合使用均可产生类似结果。且不同的己糖类升高 dystrophin 蛋白水平的作用效果在不同肌群中显示出明显的差异性（如下图）。
2、PMO-GF 可产生长时程治疗效应和功能改善
静脉注射较低剂量 PMO-GF 可明显增加除心脏以外的其他周围肌群中 dystrophin 阳性肌纤维数目，同时在大多数被检测肌肉组群中都检测到因外显子 23 跳跃产生的较短基因条带（如下图）。在 PMO-GF 组，股四头肌、腓肠肌和腹肌中的 dystrophin 蛋白可恢复到接近正常水平，特别是横隔膜肌肉中的升高水平达到 8 倍以上，并伴随 dystrophin 相关蛋白复合物（DAPC）发生重排、血浆肌酸磷酸激酶（CK）水平的降低。在 PMO-GF 治疗组，特别是治疗后期，抓力测试显示出明显的力量恢复，此外血浆众多生化指标均提示治疗未造成明显的肝肾损伤、血糖水平异常升高或者炎性细胞激活（如下图）。
3、核酸摄入增加需要激活 GF 转运
作者还比较了分离注射和同时注射后的 PMO-GF 组的效应差异，结果表明分离注射 PMO 和 GF 未见明显增强 dystrophin 阳性肌纤维和外显子跳跃的效应，所有外周肌群对 PMO 的摄取都显著增加，GF 也可广泛促进其他多种核酸的摄取，而给予葡萄糖和 GF 转运体抑制剂可取消 GF 对 PMO 的增强作用（如下图）。
4、GF 代谢促进核酸摄取
实验证明，如果用不能被代谢的类似物 2-脱氧葡萄糖（2-DG）替代 GF,则 GF 增强 PMO 的作用消失。这一结果强烈提示 GF 代谢而非共转运参与了 PMO-GF 的效应。为了证实这一假设，作者首先通过肌肉注射 AAV-shRNA（病毒包装由和元生物提供）敲低肌肉磷酸果糖激酶 1（Muscle Phosphofructokinase-1,PFKm），引起同一肌肉中的 ATP 水平明显降低，然后再注射 PMO-GF,结果提示干扰组肌肉中 dystrophin 表达显著降低。此外，mdx 小鼠肌肉单独注射 ATP 合成酶抑制剂也会降低基础 ATP 水平，如果共同给予 PMO-GF 和 ATP 合成酶抑制剂，则可明显抑制外显子跳跃活性（如下图）。
5、GF 补充细胞能量储备
同时给予 ATP 和 PMO,两者作用未出现叠加，说明两者是通过同一途径发挥作用。与对照组相比，mdx 小鼠中骨骼肌 ATP 产生明显减少，注射 PMO-GF 可使肌肉 ATP 水平部分恢复。细胞能量补充促进肌肉摄取 PMO 的通路还在成肌细胞 C2C12 中进行了验证，clathrin 依赖和非依赖性机制都参与了胞吞摄取 PMO 的过程。成肌细胞 C2C12 饥饿 6 小时模拟小鼠肌肉能量缺乏状态，后给予 GF 可显著增加细胞内 ATP 水平，与此同时 GF 处理可明显增加饥饿细胞的 PMO 摄取。这些直接证据都支持在细胞处于能量缺乏状态时 GF 能增加 PMO 的摄取（如下图）。
结语
本文通过联合使用 PMO 和不同种类己糖如 5% 葡萄糖和 GF，观察了对 PMO 递送改善 PMO 治疗 dystrophin 缺馅小鼠的作用。反复联合给予 PMO 和 GF 可增加外显子跳跃并使 dystrophin 蛋白表达增加，这一作用是由于 GF 代谢生成的 ATP 促进肌肉摄取 PMO 增加引起的。本文阐述的碳水化合物参与寡核苷酸递送的概念将对 MDM 外显子跳跃治疗提供更为有效的治疗策略。
Duchenne 型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是儿童中最常见的类型，患者由于持续性肌肉退化和萎缩，通常 20 岁左右便会死亡，直到今天，对这一疾病人们仍未有很好的治疗方案。本期解读的就是天津医科大学尹海芳教授研究组发表在《Nature Communications》上的题为《Hexose enhances oligonucleotide delivery and exon skipping in dystrophin-deficient mdx mice》的最新研究论文，研究结果为探寻有效的 DMD 治疗策略提供了新思路。文中的腺相关病毒（AAV）包装由和元生物提供。
前言
肌肉萎缩疾病是困扰人类多年的一类重大疾病，主要表现为肌肉营养不良，难以行动，代谢紊乱，许多病人寿命很短。在多种肌肉萎缩症中，DMD 是最为凶险的一种，骨骼和肌肉发育畸形，随着病情的进展，病变会波及心脏和呼吸系统，最终造成患者心功能紊乱或呼吸衰竭而导致死亡。DMD 的发生原因在于 dystrophin 基因发生了突变使机体缺乏 dystrophin 蛋白，后者是机体用于保持肌肉细胞膜完整性的重要蛋白质。基于 DMD 的发病频率和严重程度，其已成为医学研究的重要课题。目前对这一疾病尚无有效治疗方案，但反义寡核苷酸介导的外显子跳读是目前最有应用前景的治疗方法之一。己糖（hexose）是含有六个碳原子的单糖，是单糖中最重要的糖类，与机体的营养代谢关系最密切，常见的己糖有葡萄糖、甘露糖、果糖和山梨糖等。本期解读的就是天津医科大学尹海芳教授研究组发表在《Nature Communications》上的题为《Hexose enhances oligonucleotide delivery and exon skipping in dystrophin-deficient mdx mice》的最新研究论文，该文集中论述了使用己糖可以增强外显子跳读和寡核苷酸递送，为使用寡核苷酸治疗 DMD 提供了非常有价值的基础研究依据。
研究背景
反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, AO）技术是将短的 DNA 或 RNA 运送至靶组织，通过干扰 RNA 的加工过程从而达到调整基因表达的一种技术。近年来研究人员尝试将反义核苷酸技术应用到 DMD 的治疗上，纠正受到破坏的读码框，恢复正常 dystrophin 蛋白的表达。磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers,PMO）就是一种对 DMD 具有外显子跳跃治疗潜能的 AO.小鼠静脉注射 PMO 后虽可有限增加骨骼肌中的 dystrophin 表达水平，但系统递送效率仍然有限。因此如何提高 AO 递送到肌肉细胞的效率及相应的安全性问题是该技术临床前应用研究的重点，也是解锁核酸疗法潜能、开发可广泛使用的高效递送技术的关键所在。目前临床输液中普遍使用的 5% 葡萄糖已被证明可以改善静脉注射的小干扰 RNA-外泌体、小干扰 RNA-肽复合体的稳定性。而目前尚不明确血糖浓度的升高对 AO 递送治疗 DMD 的影响。
动物模型的选取：
本文选取的 mdx 小鼠是目前研究肌营养不良的经典模型，与 DMD 患者一样，mdx 小鼠骨骼肌细胞膜上不表达 dystrophin 蛋白。mdx 小鼠的组织学在早期是正常的，在 3 周左右出现肌细胞变性坏死，表现出肌无力症状，随着疾病发展， 肌细胞再生占据主导地位，病情趋于平稳，无力症状得到改善。
研究结果
1、PMO 联合碳水化合物促进 dystrophin 缺陷小鼠表达 dystrophin首先 mdx 小鼠胫骨前肌肉联合注射 PMO 和 5% 葡萄糖后，与对照组相比，出现大量 dystrophin 阳性肌纤维，dystrophin 蛋白表达水平显著增加。不仅是 5% 葡萄糖，其他己糖类如 2.5% 葡萄糖和 2.5% 果糖混合物（GF）、5% 果糖、5% 甘露糖分别与 PMO 联合使用均可产生类似结果。且不同的己糖类升高 dystrophin 蛋白水平的作用效果在不同肌群中显示出明显的差异性（如下图）。
2、PMO-GF 可产生长时程治疗效应和功能改善
静脉注射较低剂量 PMO-GF 可明显增加除心脏以外的其他周围肌群中 dystrophin 阳性肌纤维数目，同时在大多数被检测肌肉组群中都检测到因外显子 23 跳跃产生的较短基因条带（如下图）。在 PMO-GF 组，股四头肌、腓肠肌和腹肌中的 dystrophin 蛋白可恢复到接近正常水平，特别是横隔膜肌肉中的升高水平达到 8 倍以上，并伴随 dystrophin 相关蛋白复合物（DAPC）发生重排、血浆肌酸磷酸激酶（CK）水平的降低。在 PMO-GF 治疗组，特别是治疗后期，抓力测试显示出明显的力量恢复，此外血浆众多生化指标均提示治疗未造成明显的肝肾损伤、血糖水平异常升高或者炎性细胞激活（如下图）。
3、核酸摄入增加需要激活 GF 转运
作者还比较了分离注射和同时注射后的 PMO-GF 组的效应差异，结果表明分离注射 PMO 和 GF 未见明显增强 dystrophin 阳性肌纤维和外显子跳跃的效应，所有外周肌群对 PMO 的摄取都显著增加，GF 也可广泛促进其他多种核酸的摄取，而给予葡萄糖和 GF 转运体抑制剂可取消 GF 对 PMO 的增强作用（如下图）。
4、GF 代谢促进核酸摄取
实验证明，如果用不能被代谢的类似物 2-脱氧葡萄糖（2-DG）替代 GF,则 GF 增强 PMO 的作用消失。这一结果强烈提示 GF 代谢而非共转运参与了 PMO-GF 的效应。为了证实这一假设，作者首先通过肌肉注射 AAV-shRNA（病毒包装由和元生物提供）敲低肌肉磷酸果糖激酶 1（Muscle Phosphofructokinase-1,PFKm），引起同一肌肉中的 ATP 水平明显降低，然后再注射 PMO-GF,结果提示干扰组肌肉中 dystrophin 表达显著降低。此外，mdx 小鼠肌肉单独注射 ATP 合成酶抑制剂也会降低基础 ATP 水平，如果共同给予 PMO-GF 和 ATP 合成酶抑制剂，则可明显抑制外显子跳跃活性（如下图）。
5、GF 补充细胞能量储备
同时给予 ATP 和 PMO,两者作用未出现叠加，说明两者是通过同一途径发挥作用。与对照组相比，mdx 小鼠中骨骼肌 ATP 产生明显减少，注射 PMO-GF 可使肌肉 ATP 水平部分恢复。细胞能量补充促进肌肉摄取 PMO 的通路还在成肌细胞 C2C12 中进行了验证，clathrin 依赖和非依赖性机制都参与了胞吞摄取 PMO 的过程。成肌细胞 C2C12 饥饿 6 小时模拟小鼠肌肉能量缺乏状态，后给予 GF 可显著增加细胞内 ATP 水平，与此同时 GF 处理可明显增加饥饿细胞的 PMO 摄取。这些直接证据都支持在细胞处于能量缺乏状态时 GF 能增加 PMO 的摄取（如下图）。
结语
本文通过联合使用 PMO 和不同种类己糖如 5% 葡萄糖和 GF，观察了对 PMO 递送改善 PMO 治疗 dystrophin 缺馅小鼠的作用。反复联合给予 PMO 和 GF 可增加外显子跳跃并使 dystrophin 蛋白表达增加，这一作用是由于 GF 代谢生成的 ATP 促进肌肉摄取 PMO 增加引起的。本文阐述的碳水化合物参与寡核苷酸递送的概念将对 MDM 外显子跳跃治疗提供更为有效的治疗策略。