CRISPR-Cas9 助力遗传性心脏病的治疗

导读

PRKAG2 心脏综合症是PRKAG2基因遗传缺陷导致的常染色体显性遗传病，患者会出现室性心动过速和进行性心力衰竭。由于该病源起杂合功能获得性突变，因此难以使用传统的基因导入方法进行治疗，亟需寻找新的有效治疗手段。本次解读的是8月30号由武汉大学生命科学学院宋保亮教授和复旦大学附属中山医院颜彦教授合作发表在高分国际期刊《Cell Research》上的最新原创论文，题为《Genome editing with CRISPR/Cas9 in postnatal mice corrects PRKAG2 cardiac syndrome》，文中揭示了在体CRISPR/Cas9 基因编辑可通过选择性破坏致病突变基因治疗 PRKAG2 心脏综合症。其中的病毒包装由和元生物提供（www.oobio.com.cn）。

摘要

本文在家族性Wolff-Parkinson-White（WPW）综合症患者的 PRKAG2发现了HR530突变，之后建立了HR530 PRKAG2转基因和基因敲入小鼠，均表现心肌肥大、糖原沉积等心脏病表型，提示HR530突变与PRKAG2 心脏综合症相关。作者下一步结合使用腺相关病毒9（AAV9）和CRISPR/Cas9基因编辑系统，破坏编码HR530的突变PRKAG2等位基因而保持野生型等位基因的完整。方法是在小鼠出生后 4 天或 42 天整体注射 AAV9-Cas9/sgRNA,可明显恢复H530R PRKAG2转基因和基因敲入小鼠的心脏形态和功能。本文结果说明在体CRISPR/Cas9基因编辑是可通过选择性破坏致病突变基因治疗PRKAG2 心脏综合症及其他遗传性心脏病的有效手段。

研究背景

WPW综合症是预激综合症中的最常见类型，是由于AMPKγ2亚基的 PRKAG2基因发生突变所致，患者心脏由于存在异常的电传导通路而引起心脏发生心动过速。AMPK作为一个异源三聚体蛋白，是机体能量代谢的开关。它由α、β、γ三个亚基组成，α亚基是催化部位，β、γ亚基是调节部位，能量缺乏会增加机体AMP/ATP比率，触发AMP与γ亚基结合，激活AMPK磷酸化。现已证实AMPK上游的腺苷-磷酸激活蛋白激酶（AMPKK）磷酸化AMPK的主要位点是位于其催化部位的α亚基的Thr-172, 这一位点的磷酸化对于AMPK的激活是必需的。PRKAG2 突变会损害AMPK对能量状态的敏感性，并引发糖原储积心肌病。此外研究还表明在出生后早期阶段抑制一种致病突变PRKAG2转基因（N488I）的表达，可成功逆转 PRKAG2综合症。特别是近年来CRISPR/Cas9 系统作为基因编辑工具已被广泛用于删除、添加、激活或抑制生物体的目标基因，但目前对于使用CRISPR/Cas9 系统治疗显性遗传心脏疾病如PRKAG2 心脏综合症的效果尚不清楚。

研究结果

1、家族性WPW综合症患者PRKAG2 H530R 突变的鉴定

首先对两位母子患者的心电图和超声心动图检查都显示特征性的PRKAG2相关家族性WPW综合症的表现如心室预激， 进展性传导系统疾病和心脏肥大。对家族PRKAG2基因测序结果显示这两位患者发生了杂合错义突变（c.1589A>G），这一突变使PRKAG2蛋白530残基上的的组氨酸被精氨酸所替代（H530R）。对这一家族的其他成员进一步分析发现，祖父也携带这一杂合突变，表现出传导异常和心脏肥厚，而其他健康的家族成员都是纯合的野生型PRKAG2基因。说明H530R 突变与PRKAG2 心脏综合症相关并表现出显性遗传。


图1 在一个WPW综合症家族中鉴定PRKAG2基因的H530R错义突变

2、H530R突变造成PRKAG2 心脏综合症

作者使用心脏特异性α-MHC启动子建立了表达野生型（Tg-WT）和H530R（Tg-H530R）PRKAG2的转基因小鼠模型。结果发现Tg-H530R 小鼠心室壁明显增厚，PR 间期缩短，QRS时程延长，且心脏重量与对照组相比明显增加。Tg-H530R 小鼠心肌细胞内出现大量非脂肪空泡，并充满PAS阳性纤维，心肌糖原含量也显着升高，类似临床PRKAG2 心脏综合症病人的表现。

此外，作者还建立了基因敲入杂合小鼠+/H530R,该小鼠携带一个类似人c.1589A>G 的核苷酸突变，即 H527R突变。+/H530R 小鼠左室壁轻度增厚，心脏大小和重量也显着增加，并有明显的糖原储积，这也与 Tg-H530R 小鼠表现类似（图 2）。


图 2 H530R 基因敲入小鼠表现类似 PRKAG2心脏综合症

3、CRISPR/Cas9 系统的特异性设计

CRISPR/Cas9 系统是强大的基因编辑工具，而 AAV9 介导的感染可优先将目标基因导入到心脏细胞，作者在本工作中将两者结合起来使用以定位于 PRKAG2心脏综合症相关的PRKAG2 突变。首先比较了多种不同路径下 AAV9 介导的基因递送效率和特异性（AAV 包装由和元提供，www.oobio.com.cn）。其中心包注射AAV9-EGFP 后心脏组织中的 EGFP 表达最弱，心肌注射后 EGFP 表达则较为局限，而尾静脉或心室注射会在心脏产生较强的 EGFP 表达，因此在本文后续试验中都采用尾静脉或心室注射的方式。作者基于人 PRKAG 序列设计了 4 条 sgRNA,并在野生型及纯合 H530R 基因敲入的人胚胎干细胞上进行有效验证，T7E1 分析显示只有 sgRNA-m3 高度特异。sgRNA-m3 在 H530R 位点的打靶效率高达 24%,而在野生型或其他预测的脱靶位点几乎检测不到。在出生后4天或42天将 Cas9-sgRNA-m3 导入+/H530R 小鼠，经检测 H530R 位点的打靶效率分别约为 6.5% 和 2.6%,且大部分打靶点均在 Cas9 切割点附近从而产生移码突变。提示 sgRNA-m3 可特异性靶向 PRKAG2突变位点（图 3）。


图 3 CRISPR/Cas9 系统特异性靶向人和鼠 H530R突变位点

4、CRISPR/Cas9 介导的基因编辑可逆转PRKAG2心脏综合症

+/H530R 小鼠注射 Cas9-sgRNA-m3 后，心脏大小、重量、左室壁厚度均降低，还观察到心肌糖原含量显着下降。此外在透射电镜下，注射后心肌纤维的排列更加规则，细胞内空泡数和糖原颗粒都减少，说明 AAV9-Cas9/sgRNA-m3 注射可使+/H530R小鼠的心脏变得类似野生型（图 4）。

在 Tg-H530R小鼠上的改善效果则更为明显，典型的心力衰竭特征如左室壁和室间隔增厚、左室腔扩大、左室短轴缩短率和左心室射血分数降低等指标在注射后均被有效逆转并可回复到正常水平，PR间期和 QRS 波也都回复正常，并显着减少心室预激的发生比例（图 5）。

图 4 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑可校正基因敲入小鼠模型的PRKAG2心脏综合症


图 5 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑可校正 PRKAG2心脏综合症转基因小鼠模型的心脏功能

结论

PRKAG2 心脏综合症作为一种难治性心脏病，在临床治疗方面仍缺乏有效手段。而在基因治疗研究领域，由于其杂合显性遗传特性，又有相当的难度。本文采用 AAV9 结合 CRISPR/Cas9基因编辑系统成功校正了 PRKAG2 心脏综合症小鼠模型的基因突变，并逆转了心脏病表型，恢复心脏功能。这一发现为临床使用基因分子手段治疗 PRKAG2 心脏综合症及其他遗传性心脏病提示了广阔的应用和发展前景。