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载体构建、慢病毒包装整体服务及应用介绍
人阅读 发布时间:2020-03-27 14:29
1.1 慢病毒介绍
慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是 RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,借助慢病毒载体可以进行基因的过表达、干扰、敲除和内源性激活等操作,满足不同的基因操作需求,同时慢病毒具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为 DNA,形成 DNA 整合前复合体,进入细胞核后,DNA 整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录成 mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生小 RNA。慢病毒介导的基因表达或小 RNA 干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂(图 1)。
图 1 慢病毒的包装和侵染细胞过程
慢病毒载体具有宿主范围广,免疫原性低,基因容量大,可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达,因而可构建稳定细胞株,用于基因的细胞功能研究。使用慢病毒载体改造 T 细胞可用于 CAR-T 细胞治疗,CRISPR/Cas9 文库构建使用的也是慢病毒载体。
1.2 慢病毒载体优势
1)表达时间长:慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上,实现基因长时间稳定的表达,不随细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的较好的选择,常用于构建稳定株。
2)安全性高:未发现致病性,慢病毒载体改造 T 细胞用于 CAR-T 细胞治疗。
3)免疫原性低:直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验。
不同病毒载体特点
1.3 常规应用
体外感染细胞
慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。
慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,因而可以达到持久性表达,从而构建稳转细胞株,用于基因的细胞功能研究。
慢病毒体外感染细胞的效果图
常见MOI列表
1.4 案例介绍(和元客户文章)
1.4.1 慢病毒在肿瘤研究中的应用
常通过构建稳转株,体外进行细胞功能学实验,进一步构建肿瘤模型,验证基因功能。
1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 胶质细胞瘤]
慢病毒干扰: Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1
2. Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]
慢病毒过表达/干扰:pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro
1.4.2 慢病毒在神经系统的应用(在体注射)
1.Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 学习与记忆]
病毒类型:慢病毒
载体名称:LV-Suv39h1-RNAi(不确定详细的)
注射部位:海马 DG 区
病毒注射量:2 μL,9.98 × 108 TU/mL
检测时间:2 周
2.Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神经环路]
病毒类型:慢病毒
载体名称:LV- CX36-shRNA-EGFP(不确定详细的)
注射部位:P1 小鼠新皮层 L1
病毒注射量:1μL
检测时间:2 周
3.Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自闭症]
病毒类型:慢病毒
载体名称:Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位:小鼠海马 CA1 区
病毒注射量:1μL
检测时间:4 周
1.5 慢病毒延伸服务
和元上海慢病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒或四质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过 qPCR 对病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下我们的慢病毒的滴度在108~109TU/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。
慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是 RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,借助慢病毒载体可以进行基因的过表达、干扰、敲除和内源性激活等操作,满足不同的基因操作需求,同时慢病毒具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为 DNA,形成 DNA 整合前复合体,进入细胞核后,DNA 整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录成 mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生小 RNA。慢病毒介导的基因表达或小 RNA 干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂(图 1)。
慢病毒载体具有宿主范围广,免疫原性低,基因容量大,可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达,因而可构建稳定细胞株,用于基因的细胞功能研究。使用慢病毒载体改造 T 细胞可用于 CAR-T 细胞治疗,CRISPR/Cas9 文库构建使用的也是慢病毒载体。
1.2 慢病毒载体优势
1)表达时间长:慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上,实现基因长时间稳定的表达,不随细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的较好的选择,常用于构建稳定株。
2)安全性高:未发现致病性,慢病毒载体改造 T 细胞用于 CAR-T 细胞治疗。
3)免疫原性低:直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验。
不同病毒载体特点
慢病毒 | 腺相关病毒 | 腺病毒 | 逆转录病毒 | |
包膜 | 有 | 无 | 有 | 有 |
颗粒直径 | 90-100 nm | 20-30 nm | 60-90nm | ~100nm |
基因组 | dsRNA | ssDNA | dsDNA | RNA |
插入目的片段大小 | 4kb左右 | 2.8kb 左右 | 6kb 左右 | 1kb 左右 |
外源基因表达时间 | 2-4 天开始表达,长时间稳定表达 | 7-14 天开始表达 | 1-2 天开始表达,作用时间 2 周左右 | 2-3 天开始表达 |
体内扩散能力 | 一般 | 强 | 强 | 一般 |
免疫原性 | 中等 | 极低 | 强 | 中等 |
滴度范围 | 108~109TU/mL | 1012-1013VG/mL | 1010-1011PFU/mL | 107~108TU/mL |
滴度检测方法 | qPCR 整合 DNA | qPCR 非整合 DNA | 抗原抗体免疫染色试剂盒 | qPCR 整合 DNA |
整合方式 | 随机高频整合 | 定向低频整合(rAAV不整合) | 非整合 | 随机整合 |
应用范围 | 体外细胞感染,gRNA 文库筛选,体内 | 基于不同的血清型,体内广泛应用 | 嗜肝,快速表达或短期表达,血液、心脏,细胞系等 | 特异性只感染分裂期的细胞 |
1.3 常规应用
体外感染细胞
慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。
慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,因而可以达到持久性表达,从而构建稳转细胞株,用于基因的细胞功能研究。
慢病毒体外感染细胞的效果图
常见MOI列表
细胞名 | 中文名称 | 慢病毒感染MOI |
MGC80-3 | 人胃癌细胞 | 10 |
HT-29 | 人结肠癌细胞 | 20 |
RKO | 人结肠腺癌细胞 | 10 |
Caki-1 | 人肾透明细胞癌皮肤转移细胞 | 10 |
5637 | 人膀胱癌细胞 | 10 |
U-118 MG | 人脑星形胶质母细胞瘤 | 10 |
RWPE-1 | 人正常前列腺上皮细胞 | 20 |
HeLa | 人宫颈癌细胞 | 10~20 |
Ca Ski | 人宫颈癌肠转移细胞 | 10 |
MCF7 [MCF-7] | 人乳腺癌细胞 | 10 |
A549 | 人非小细胞肺癌细胞 | 10(中科院为40-80) |
NCI-H1299 | 人非小细胞肺癌细胞 | 20 |
U-87 MG | 人脑星形胶质母细胞瘤 | 10 |
U251 | 人胶质瘤细胞 | 10 |
A172 | 人胶质母细胞瘤细胞 | 10 |
K-562 | 人慢性髓原白血病细胞 | 10 |
HL-60 | 人原髓细胞白血病细胞 | 10 |
GES-1 | 人胃上皮细胞 | 20 |
U266 | 人骨髓瘤细胞 | 20 |
CAL 27 | 人舌鳞癌细胞 | 20 |
PC9 | 人肺癌细胞 | 5 |
PC14 | 人肺癌细胞 | 10 |
MADB-106 | 大鼠乳腺癌细胞 | 20 |
F98 | 大鼠脑胶质瘤细胞 | 20 |
MHCC-97H | 人肝癌细胞(高转移) | 10~20 |
1.4 案例介绍(和元客户文章)
1.4.1 慢病毒在肿瘤研究中的应用
常通过构建稳转株,体外进行细胞功能学实验,进一步构建肿瘤模型,验证基因功能。
1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 胶质细胞瘤]
慢病毒干扰: Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1
慢病毒过表达/干扰:pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro
1.Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 学习与记忆]
载体名称:LV-Suv39h1-RNAi(不确定详细的)
注射部位:海马 DG 区
病毒注射量:2 μL,9.98 × 108 TU/mL
检测时间:2 周
2.Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神经环路]
载体名称:LV- CX36-shRNA-EGFP(不确定详细的)
注射部位:P1 小鼠新皮层 L1
病毒注射量:1μL
检测时间:2 周
3.Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自闭症]
载体名称:Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位:小鼠海马 CA1 区
病毒注射量:1μL
检测时间:4 周
1.5 慢病毒延伸服务