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病毒载体在神经科学领域的研究

发布时间:2017-08-17 17:30 |  点击次数:

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病毒载体在神经科学领域的研究

 

病毒载体简介

神经科学是近年来快速发展的前沿学科,从“认识脑”、“保护脑”, 到“模拟脑”,人们正在努力理解神经系统的工作原理。在理解的研究中,我们需要利用多种多样的工具,病毒载 体就是其中非常重要和关键的工具之一。

在神经系统的研究中,比较常用的病毒载体包括 腺相关病毒慢病毒腺病毒逆转录病毒,这四种病毒载体各有其特点,需根据其自身特性和 研究目的选择使用。利用不同病毒,我们可以研究神经科学各个层面的主要问题,而腺相关病毒(AAV)则是神经科学领域最常应用的病毒载体:

图1 病毒载体

1、细胞、神经环路标记(Labeling)

神经系统是全身最为特殊的系统,主要包含神经元和胶质细胞两种细胞类型。众所周知,神经元是不分裂的细胞,以突触(Synapse)的形式与其他神经元形成神经环路、神经网络;而神经系统的胶质细胞也是一类特别的、功能多样的细胞。因此,在研究中,我们常会涉及对特定脑区、特定环路或特定细胞群体进行标记的实验:

(1)特定细胞标记

策略1:使用不同启动子(如标记锥体细胞的CaMKIIα启动子、标记成熟神经元的Syn启动子)。

图2 特定细胞标记

策略2:使用特定细胞表达Cre重组酶的模式动物,配合携带DIO-gene元件的AAV病毒,达到Cre控制特异表达的结果。

(2)神经环路标记

使用不同血清型的AAV病毒,实现对神经环路的顺向/逆向、跨突触/不跨突触的标记。

普通AAV血清型(如AAV2/8、AAV2/9)均具有感染神经元后在全细胞表达的效果,即所谓的顺向、不跨突触标记,可以用来观测直接投射通路。

而如果要逆向、不跨突触,目前最好的策略是新血清型rAAV2-Retro,该病毒能够被轴突末端摄取,而后逆向转运到细胞核,表达所需目的基因,从而达到逆向标记或操控的目的。

如果研究中需要跨突触标记神经环路,过去使用的策略包括狂犬病毒(RV)、伪狂犬病毒(RPV)或单纯疱疹病毒(HSV),这些嗜神经病毒虽然标记效果强,但是其免疫原性也很强,只适合用于神经环路的解析,并不适用于生理研究。因此,我们需要使用AAV这种免疫原性低的病毒来进行操作:

顺向跨突触的AAV2/1型病毒:根据2016年南加州大学Li I. Zhang教授的研究,高滴度的AAV2/1能够在皮层-SC的投射环路中达到顺向跨突触。

图4 顺向跨突触

如果需要逆向跨突触标记,可以借助AAV病毒及WGA-Cre策略,具体应用可联系和元上海讨论。

图5 逆向跨突触

2、基因操作(Genetic manipulation)

除了能够对细胞或神经环路进行标记,我们还希望能对特定细胞进行基因操作。在这个范畴内,我们一般可以做到功能获取(Gain of function)或者功能缺失(Loss of function)。

(1)Gain of function

最常用的技术是外源基因过表达,例如下图中,使用AAV直接在神经元过表达BDNF:

图6 Gain of function-AAV BDNF

目前,除了常见的AAV过表达外源基因,我们还可以借助CRISPRa的手段对内源基因进行激活,达到过表达的目的。

(2)Loss of function

最常用的技术包括基因敲除和RNA干扰。
    可以利用Cre-Loxp的体系,对转基因动物的目的基因进行基因敲除。

图7 Loss of function-Cre-loxP

如果不需要对基因进行敲除,仅需要降低表达水平,那么我们可以选择对目的基因的转录进行干扰,即基因敲低。利用病毒载体,我们可以轻松地将干扰的shRNA表达在特定细胞中,观察表型变化。

(3)基因编辑(Gene editing)

目前,全世界最火热的CRISPR/Cas9基因编辑技术已被应用到各个研究领域。神经科学领域中,人们已经大量尝试 CRISPR/Cas9技术进行基因敲除、基因敲低或模式动物的构建等工作。

值得一提的是,目前,和元上海已开展针对内源基因的转录激活/转录抑制研究,其原理基于dCas9技术,这种对内源基因的调控未来必将在研究中大放异彩。

3、生理操作和观察(Physiological manipulation and observation)

除了标记和基因操作,越来越多的研究已经开始利用病毒载体对动物的神经生理活动进行操控或者观察,如光遗传学技术和钙成像技术。

(1)光遗传学技术

光遗传学(optogenetics)是结合了光学(optics)及遗传学(genetics)的技术,能在活体动物甚至是自由运动的动物脑内,精准地控制特定种类神经元的活动。光遗传学在时间上的精确度可达到毫秒级别,在空间上的精确度则能达到单个细胞级别。该项技术目前在神经科学领域应用非常广泛,用于研究生理、药理、病理等范畴。下图为2017年的两篇研究,利用光遗传学技术研究学习和记忆的环路机制,以及癫痫疾病的治疗。

图9 光遗传技术

(2)化学遗传学技术

化学遗传学是指:对一些生物大分子实行改造,使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用的过程。化学遗传学和分子遗传学一样,均是遗传学的一个分支,由于其可控的、可逆的(可以随时加入或除去化合物,从而启动或中断特定的反应)特性,已经在信号转导、药物开发、功能基因组学等方面的研究中得到了广泛的应用。

借助病毒载体,我们可以在脑中特定细胞或特定环路表达化学遗传学的体系,操控或检测行为相关的神经机制。

图10 化学遗传技术

(3)钙成像技术

钙成像技术(Calcium imaging)是指利用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度的方法。钙离子的浓度变化可以表征神经元的活动,因此我们可以借助钙成像技术同时监测成百上千神经元内钙离子的变化,从而检测神经元的活动情况。借助病毒载体,我们可以在特定脑区或细胞表达GCaMP蛋白,指示钙离子的变化。

图11 钙成像技术

4、新应用

除上述应用外,目前人们也在非人灵长类动物的工作中大量应用病毒进行研究,如AAV病毒构建疾病模型或观察猕猴的脑活动。

此外,和元上海目前不断开发新的血清型用于研究,我们将尽力提供最好的工具给您!

5、其他相关应用

光遗传     化学遗传     神经环路示踪    钙离子成像     CRISPR/Cas9

Cre-LoxP     RNA干扰     基因过表达     microRNA表达    microRNA抑制